L'invention concerne le domaine de la biotechnologie, en particulier un procédé d'administration ciblée d'ADN dans des cellules tumorales et souches exprimant le récepteur CXCR4. La présente invention peut être utilisée pour l'administration ciblée de constructions génétiques dans des cellules souches et de tumeurs malignes dans le but de corriger des défauts génétiques et de prévenir des maladies. Le procédé consiste à préparer des supports de constructions génétiques en incluant dans la composition des molécules porteuses, qui est une séquence de liaison à l'ADN de huit résidus d'acides aminés de lysine - KKKKKKKK, des séquences signal. La connexion de la séquence signal à la séquence de liaison à l'ADN est réalisée à l'aide d'une région de liaison de deux molécules d'acide ε-aminohexanoïque. Des complexes ADN/support se forment alors. La transfection est ensuite réalisée in vitro. L'invention proposée permet d'augmenter l'efficacité de l'administration du gène d'intérêt aux cellules tumorales et souches. 2 salaire f-ly, 4 malades.
L'invention concerne la médecine génétique, thérapie génique, la biotechnologie et les produits pharmaceutiques et peuvent être utilisés pour l'administration ciblée de constructions génétiques dans des cellules souches et des cellules tumorales malignes dans le but de corriger des défauts génétiques et de prévenir des maladies. La spécificité tissulaire de la délivrance des constructions génétiques est assurée grâce à l'utilisation de séquences signal pour le récepteur CXCR4, qui est exprimé dans les cellules de ce type.
Thérapie génique à partir d'approches la médecine traditionnelle Elle se distingue par l’accent mis sur la lutte contre la cause de la maladie plutôt que contre ses symptômes et ses conséquences. Actuellement, des approches de thérapie génique sont développées pour traiter ou prévenir un large éventail de maladies humaines. Ces approches peuvent être applicables à la thérapie in vivo et ex vivo. La thérapie in vivo repose sur l’introduction directe de constructions génétiques directement dans les tissus corporels. L'administration peut être intraveineuse à l'aide de nébuliseurs aérosols ou d'injections dans des tissus spécifiques. La thérapie génique ex vivo repose sur l'isolement d'un type spécifique de cellules du corps, l'introduction d'une construction génétique « thérapeutique », la sélection des cellules transfectées et leur réimplantation ultérieure chez le patient.
Il existe trois directions principales dans les approches de fourniture de constructions génétiques actuellement développées :
1) clonage dans le cadre de vecteurs viraux ;
2) l'utilisation de méthodes de transfection physique ;
3) l'utilisation de complexes de vecteurs d'expression plasmidiques et de molécules porteuses non virales.
Le transfert par virus est une méthode très efficace pour délivrer l’ADN aux cellules cibles, puisque la pénétration du vecteur viral modifié est similaire au processus qui se produit naturellement lorsque le génome viral est transféré dans les cellules hôtes. Les plus étudiés sont les vecteurs créés à partir de virus rétro-, adéno- et adéno-associés. Les avantages des virus comprennent, tout d'abord, la combinaison des propriétés d'un vecteur d'expression et d'un support, la possibilité d'une délivrance spécifique, la capacité de transfecter des cellules en division et non en division et la capacité d'intégrer l'ADN dans le chromosome pour assurer une expression à long terme. En raison de ces avantages, cette approche est encore largement utilisée dans la recherche sur la délivrance de gènes, même si elle présente certains inconvénients. Les virus rétro- et adéno-associés présentent une taille limitée du fragment d'ADN cloné et un risque de mutagenèse insertionnelle lorsque le virus est intégré dans le génome de l'hôte. Un inconvénient sérieux des vecteurs adénoviraux est la réponse immunitaire prononcée à des doses élevées et administrations répétées constructions adénovirales (Walther W., Stein U. Vecteurs viraux pour le transfert de gènes : une revue de leur utilisation dans le traitement des maladies humaines // Médicaments. - 2000. - v.60. - P.249-271, brevet RF n° 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, publié le 20/05/2005).
L’injection de constructions d’ADN plasmidique nu a été l’une des premières approches dans le développement de stratégies de traitement par thérapie génique. La faible efficacité de la transfection utilisant de l’ADN nu a incité au développement de nouvelles méthodes de délivrance de constructions génétiques. Diverses méthodes physiques permettant de transmettre l’ADN aux cellules du corps ont été étudiées. Les plus populaires d’entre elles sont la méthode de transfection balistique et l’électroporation, largement utilisées pour transfecter les cellules cutanées et musculaires. La méthode de transfection balistique repose sur la pénétration dans la cellule d'ADN déposé sur des microparticules d'or ou de tungstène. La transfection se produit sous la pression d'un flux de gaz ou de liquide comprimé. La méthode d'électroporation est basée sur le changement local potentiel électrique membrane cellulaire en raison de l’exposition au courant électrique. Les impulsions électriques entraînent la formation de pores dans la membrane cellulaire, la rendant ainsi perméable aux biomolécules. Pour surmonter la faible efficacité de la transfection d'ADN nu in vivo, la méthode du choc hydrodynamique est également utilisée - administration intraveineuse ou intra-artérielle d'un vecteur plasmidique dans une solution de grand volume. Les principaux inconvénients des méthodes de transfection physique existantes sont la faible efficacité et la faible localisation de l’effet de la délivrance d’ADN. Ils permettent au plasmide de franchir la membrane cellulaire et d'éviter son inclusion dans les endosomes, empêchant ainsi la dégradation enzymatique, mais, en règle générale, ne garantissent pas la persistance à long terme des constructions génétiques introduites (Wells D.J. Gene Therapy progress and prospects: electroporation and other méthodes physiques // Gene Ther. - 2004. - v.11, n° 18. - P.1363-1369 ; Wang S., Joshi S., Lu S. Délivrance d'ADN à la peau par bombardement de particules // Méthodes Mol Biol . - 2004. - v.245. P.185-196 ; Herweijer H., Wolff J.A. Progrès et perspectives : transfert de gènes à ADN nu et thérapie // Thérapie génique.
Les porteurs non viraux constituent une alternative au transfert de constructions génétiques dans des cellules de mammifères par l'intermédiaire d'un virus. Les supports non viraux sont facilement synthétisés et la facilité de leur modification permet d'apporter des modifications à la structure et à la composition des molécules, améliorant ainsi les véhicules d'administration. Lors de l’utilisation de supports non viraux, il n’existe aucune restriction quant à la taille du vecteur d’expression délivré. De plus, ils sont moins toxiques, ne provoquent dans la plupart des cas pas de réponse immunitaire spécifique et sont plus sûrs pour une utilisation in vivo que les vecteurs viraux. Par conséquent, l’introduction d’une construction génétique conditionnée dans des supports non viraux peut être répétée. L'étude des porteurs non viraux se développe dans le sens de l'amélioration des propriétés transfectantes de l'ADN plasmidique en formant des complexes d'ADN avec divers composés synthétiques (lipides, oligo- et polypeptides, polymères, etc.) (par exemple, brevet RF n° 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, publié 20.10.2008). L'amélioration des véhicules de distribution non viraux dépend en grande partie d'une compréhension détaillée des barrières à la pénétration de l'ADN dans les cellules du corps (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human genetherapy: an mise à jour // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72 ; // Med Sci Monit.11, n° 4. - P.110-121 ; Wiethoff C.R. Obstacles à la délivrance de gènes non viraux // J Pharm Sci.
On pense qu'un porteur non viral doit avoir les caractéristiques suivantes :
1) être non toxique, compact et protéger l'ADN plasmidique de la dégradation enzymatique, et être excrété par l'organisme après utilisation ;
2) assurer la pénétration du plasmide dans la cellule par liaison spécifique à la membrane plasmique de la cellule :
3) avoir la capacité de libérer l’ADN du compartiment endosomal ;
assurer la dissociation de l'ADN du complexe pour le transport ultérieur du plasmide dans le noyau.
Aux fins de la thérapie génique, la méthode la plus privilégiée pour administrer des constructions génétiques est leur transfert tissulaire spécifique dans les cellules et les tissus du corps.
La première barrière à la pénétration intracellulaire des complexes est la membrane plasmique. La plupart des complexes interagissent avec la surface cellulaire en utilisant des forces électrostatiques. Un mécanisme possible de liaison des complexes à la cellule est leur interaction avec des protéines de surface cellulaire - les glycosaminoglycanes. Cependant, avec ce mécanisme de pénétration des complexes, il n'y a pas de transfert de constructions génétiques spécifiques aux tissus. Dans le même temps, le problème de la délivrance de constructions génétiques spécifiques aux tissus est pertinent pour la thérapie génique d’un certain nombre de maladies. Pour une interaction spécifique avec la surface cellulaire, les complexes comprennent des ligands pour les récepteurs situés à la surface cellulaire. Un certain nombre de ligands peptidiques d’intégrine ont maintenant été caractérisés. Il s'agit notamment du fragment tripeptidique RGD (les intégrines sont présentes à la surface de nombreuses cellules), de la transferrine (son récepteur a une expression accrue dans les cellules en prolifération), de l'asialorosomucoïde (le récepteur de l'asialoglycoprotéine a une expression spécifique dans les hépatocytes hépatiques).
Pour la délivrance spécifique de matériel génétique aux cellules nerveuses, Zeng et ses collègues ont proposé d'utiliser un support constitué d'une région signal pour le récepteur TrkA (80 à 108 acides aminés provenant du facteur de croissance nerveuse) et d'une séquence de liaison à l'ADN de 10 résidus d'acides aminés lysine. Ce support, en présence de l'agent endosomolytique chloroquine, qui favorise la libération de complexes du compartiment endosomal de la cellule, était capable de délivrer spécifiquement le gène marqueur uniquement aux cellules exprimant le récepteur TrkA. Ce support peut être utilisé pour le traitement par thérapie génique de diverses maladies neurologiques, telles que l'épilepsie, les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. Cependant, il ne convient pas pour délivrer du matériel génétique à d'autres types de cellules (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S Un peptide synthétique contenant la boucle 4 du facteur de croissance nerveuse pour une délivrance ciblée de gènes // J Gene Med 2004 ; 6 : 1247-1256).
Les cellules souches humaines sont considérées comme des agents prometteurs pour la thérapie cellulaire et génique diverses maladies personne. En même temps, elles constituent l’un des types de cellules les plus difficiles à transfecter. Dans le traitement du cancer par thérapie génique, il est nécessaire d’assurer la transmission des gènes directement aux cellules tumorales.
CXCR4 est un récepteur de la chimiokine SDF-1α, facteur de migration des cellules souches. CXCR4 est exprimé dans les cellules hématopoïétiques, l'endothélium vasculaire et les cellules satellites musculaires. Un niveau élevé d'expression de ce gène a été constaté dans plus de 20 types de tumeurs cancéreuses (cancer du sein, cancer de la prostate, etc.), ainsi que dans les cellules souches migratrices. Le récepteur CXCR4 est également capable de se lier à la chimiokine virale vMIP-II (virus du sarcome de Kaposi). Ainsi, l’inclusion de séquences signal dans des molécules porteuses pour la liaison au récepteur CXCR4 est une manière prometteuse de créer des systèmes pour la délivrance ciblée de gènes aux cellules tumorales et souches.
Pour introduire du matériel génétique dans les cellules exprimant le récepteur CXCR4, Le Bon et ses collègues ont utilisé un ligand synthétique pour ce récepteur - AMD3100, qui a été combiné avec de la polyéthylèneimine ou des lipides cationiques. Les complexes de matériel génétique avec ces composés n’ont pas entraîné d’augmentation significative de l’efficacité de l’administration du gène marqueur dans les cellules CXCR4+ par rapport aux composés sans signaux. Les supports utilisés par Le Bon n'étaient pas efficaces car une délivrance spécifique avec leur aide n'est possible qu'avec l'ajout d'une substance favorisant l'internalisation du récepteur CXCR4 (ester de phorbol) dans le milieu de transfection. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. Conjugués AMD3100 en tant que composants de systèmes de délivrance de gènes non viraux ciblés : synthèse et efficacité de transfection in vitro de cellules exprimant CXCR4. // Bioconjugate Chem 2004 , 15 : 413-423).
Ainsi, il est nécessaire de créer un porteur de constructions génétiques capables de fournir une délivrance spécifique aux cellules CXCR4(+) et de ne pas affecter les tissus voisins. Un tel procédé est proposé par la présente invention.
L'invention repose sur la tâche consistant à développer un procédé pour l'administration spécifique de constructions génétiques dans des cellules exprimant le récepteur CXCR4, dans lequel, grâce à l'utilisation de porteurs de constructions génétiques contenant des séquences signal pour le récepteur CXCR4, une augmentation de l'efficacité de la délivrance du gène d'intérêt est obtenue. Il est important de noter que la synthèse des supports revendiqués peut être réalisée en utilisant n'importe lequel des procédés connus de synthèse peptidique en phase solide.
La solution au problème problème technique est assuré par le fait que dans la méthode d'administration ciblée d'ADN aux cellules tumorales et souches exprimant le récepteur CXCR4, y compris la préparation de porteurs de constructions génétiques en incluant dans la composition des molécules porteuses, qui est une séquence de liaison à l'ADN de huit résidus d'acides aminés lysine - KKKKKKKK, séquences signal, formation de complexes ADN/support, transfection in vitro, séquence signal choisie dans le groupe : fragment de 1 à 8 acides aminés de la séquence N-terminale de la protéine SDF-1α - KPVSLSYR; fragment de 1 à 17 acides aminés de la séquence N-terminale de la protéine SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, où les acides aminés 9 et 11 sont remplacés par de la sérine ; ou un fragment de 1 à 10 acides aminés de la séquence N-terminale de la chimiokine virale vMIP-II - LGASWHRPDK ; La connexion de la séquence signal à la séquence de liaison à l'ADN est réalisée à l'aide d'une région de liaison de deux molécules d'acide ε-aminohexanoïque.
Dans ce cas, la séquence signal peut être un fragment des acides aminés 1 à 8 de la séquence N-terminale de la protéine SDF-1α-KPVSLSYR.
Ou la séquence signal peut être un fragment des acides aminés 1 à 17 de la séquence N-terminale de la protéine SDF-1α - KPVLSSYRCPCRFFESH, où les acides aminés 9 et 11 sont remplacés par de la sérine.
Un fragment des acides aminés 1 à 10 de la séquence N-terminale de la chimiokine virale vMIP-II - LGASWHRPDK, synthétisée à partir d'acides aminés D, peut également être utilisé comme région signal.
Le glycérol ou la chloroquine peuvent être utilisés comme composant assurant la sortie des complexes constitués de porteurs et de matériel génétique des endosomes.
L'ADN plasmidique peut être utilisé comme matériel génétique pour les porteurs.
Le résultat technique spécifié dans la présente invention est obtenu grâce à l'utilisation de molécules d'oligolysine - KKKKKKKK (K8) comme support, conjuguées avec des séquences signal au récepteur CXCR4 des protéines SDF-1 ou vMIP-II, à savoir la séquence N-terminale de la chimiokine SDF-1 (c 1 à 8 aa) ou la séquence N-terminale de la chimiokine SDF-1 (de 1 à 17 aa, avec remplacement de 9 et 11 aa par la sérine) ou la séquence N-terminale de la chimiokine virale vMIP-II (de 1 à 10 aa dans la conformation D). La présence d'oligolysine KKKKKKKK dans la composition de support permet aux conjugués de former des complexes avec des acides nucléiques, en particulier avec l'ADN plasmidique, en raison d'une interaction électrostatique.
Le résultat technique spécifié est obtenu par trois variantes du support revendiqué.
Le résultat technique spécifié dans le premier mode de réalisation est obtenu par le fait que dans le support CDP court basé sur des analogues synthétiques de la chimiokine SDF-1, comprenant un composant cationique, qui est une oligolysine K8, utilisée pour la condensation de l'ADN plasmidique, et un composant ligand pour l'interaction avec le récepteur CXCR4, conformément à L'invention revendiquée utilise un fragment (1-8 aa) de la séquence N-terminale de la protéine SDF-1, qui a la structure KPVSLSYR et a l'activité d'agonistes du Le récepteur CXCR4, en tant que composant ligand, et le composant cationique du conjugué ont la structure KKKKKKKK et sont attachés au composant ligand via un espaceur - deux molécules d'acide ε-aminohexanoïque (Ahx).
Le résultat technique spécifié dans la deuxième variante est obtenu par le fait que dans un support (CDP long) à base d'analogues synthétiques de la chimiokine SDF-1, comprenant un composant cationique, qui est l'oligolysine K8, utilisé pour la condensation de l'ADN plasmidique, et un composant ligand pour l'interaction avec le récepteur CXCR4, conformément à l'invention revendiquée, un fragment (1-17 aa ; aa9 et aa11 sont remplacés par de la sérine) de la séquence N-terminale de la protéine SDF-1, qui a le structure KPVSLSYRSPSRFFESH et a l'activité d'agonistes du récepteur CXCR4, est utilisé comme composant ligand, et le composant cationique du conjugué a la structure KKKKKKKK et est attaché au composant ligand via un espaceur - deux molécules d'acide ε-aminohexanoïque.
Le résultat technique spécifié dans le troisième mode de réalisation est obtenu par le fait que dans un support (CDP viral) basé sur des analogues synthétiques de la protéine vMIP-II du virus du sarcome de Kaposi, comprenant un composant cationique, qui est une oligolysine K8, utilisé pour la condensation de ADN plasmidique, et un composant ligand pour l'interaction avec le récepteur CXCR4, conformément à l'invention revendiquée, un fragment (1-10 Daa - synthétisé à partir d'acides aminés D) de la séquence N-terminale de la protéine vMIP-II, ayant la structure LGASWHRPDK et ayant l'activité d'antagonistes du récepteur CXCR4, est utilisée comme composant ligand, et le composant cationique du conjugué a la structure KKKKKKKK et est attaché au composant ligand via un espaceur - deux molécules d'acide ε-aminohexanoïque .
Les trois variantes du support revendiqué peuvent être synthétisées en utilisant des méthodes connues de synthèse peptidique, par exemple la méthode Boc en phase solide (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society . 1963. V.85 (14), pages 2149-2154).
Exemples de mise en œuvre spécifique
L'invention est illustrée à l'aide de la figure 1, qui montre le changement d'intensité de fluorescence du bromure d'éthidium avec des rapports de charge porteur/ADN croissants dans des complexes CDP/ADN courts, CDP/ADN longs et des complexes CDP/ADN viraux. Une diminution de l'intensité de la fluorescence indique une augmentation de la densité des complexes formés. Les courbes de fluorescence atteignant un plateau indiquent que les complexes ont atteint une densité suffisante pour éteindre la fluorescence du bromure d'éthidium.
La figure 2 montre la dépendance de l'activité de la luciférase dans les cellules HeLa (CXCR4+) après transfection avec des complexes CDP/ADN courts, CDP/ADN longs et des complexes viraux CDP/ADN en présence de l'agent endosomolytique glycérol. Dans ce cas, des complexes formés aux rapports de charge porteur/ADN suivants ont été utilisés : 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. La molécule intacte, l'ADN, les complexes PEI/ADN 1/8 (un contrôle expérimental positif était le support commercial polyéthylèneimine ramifié 25 kDa - PEI) et les complexes contenant de l'ADN et un peptide témoin (CP) ont servi de contrôles expérimentaux. CP diffère des supports de la présente invention en l'absence de signal de liaison au récepteur CXCR4 et est structurellement une oligolysine KKKKKKKK. L'efficacité de la délivrance du gène marqueur par les porteurs de CDP courte, de CDP longue et de CDP virale était 10 à 100 fois supérieure à celle du contrôle CP.
La figure 3 montre la dépendance de l'activité de la luciférase dans les cellules A172 (CXCR4+) après transfection avec des complexes CDP/ADN courts, CDP/ADN longs et viraux CDP/ADN en présence de l'agent endosomolytique glycérol. Ici, nous avons utilisé des complexes formés aux rapports de charge porteur/ADN suivants : 9/1, 12/1. Une molécule d'ADN intacte, des complexes PEI/ADN 1/8 et des complexes contenant de l'ADN et du peptide CP ont servi de contrôles expérimentaux. L'efficacité de la délivrance du gène marqueur par les porteurs de CDP courte, de CDP longue et de CDP virale était 10 fois supérieure à celle du contrôle CP.
Les résultats des figures 2 et 3 soutiennent la spécificité des supports de la présente invention pour le récepteur CXCR4.
La figure 4 montre la dépendance de l'activité de la luciférase dans les cellules CHO (CXCR4-) après transfection avec des complexes CDP/ADN courts, CDP/ADN longs et des complexes viraux CDP/ADN en présence de l'agent endosomolytique glycérol. Des complexes formés aux rapports de charge porteur/ADN suivants ont été utilisés : 9/1, 12/1. Une molécule d'ADN intacte, des complexes PEI/ADN 1/8 et des complexes contenant de l'ADN et du peptide CP ont servi de contrôles expérimentaux. L’efficacité de la délivrance du gène marqueur par les porteurs de CDP courtes, de CDP longues et de CDP virales était presque la même que celle obtenue avec le contrôle CP.
Les porteurs avec un signal ne sont pas en mesure de fournir un niveau de délivrance de matériel génétique significativement plus élevé dans les cellules sans expression de récepteur par rapport au contrôle.
La mise en œuvre de l'invention peut s'expliquer comme suit. L'objectif de la présente invention est de fournir une administration ciblée de constructions génétiques dans des cellules exprimant le récepteur CXCR4 à l'aide de porteurs de matériel génétique contenant des séquences signal pour ce récepteur.
Dans un premier temps, la formation de complexes de l'un des modes de réalisation du porteur avec une construction génétique contenant le gène « d'intérêt » est réalisée. Les complexes formés sont utilisés pour délivrer du matériel génétique aux cellules cibles appropriées. L'analyse de l'efficacité de la pénétration cellulaire est évaluée à l'aide de méthodes enzymatiques ou immunohistochimiques.
La formation de complexes s'effectue dans une solution isotonique. Le mannitol tamponné par Hepes (mannitol tamponné par Hepes) est préféré. La taille des complexes résultants est de 170 à 230 nm.
L'ADN plasmidique est utilisé comme construction génétique dans un mode de réalisation.
L'ADN plasmidique contient un marqueur (luc, lacZ) ou un gène thérapeutique (selon la maladie), sous le contrôle de promoteurs et d'amplificateurs appropriés (CMV, SV40, etc.) et d'autres éléments nécessaires, par exemple, à la réplication dans la cellule hôte. ou l'intégration dans le génome. Dans le traitement du cancer par thérapie génique, les gènes HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, thymidine kinase, etc. peuvent être utilisés.
Dans un autre mode de réalisation, des oligonucléotides constitués de petits ADN ou ARN, complémentaires d'une séquence spécifique dans l'ARNm ou son précurseur, sont utilisés comme construction génétique pour supprimer la synthèse d'un produit protéique ou éliminer un exon portant une mutation de l'ARNm. Les complexes formés sont utilisés pour administrer du matériel génétique aux cellules exprimant le récepteur CXCR4. L'entrée des complexes porteurs de la présente invention se produit principalement par transport médié par le récepteur par liaison aux domaines extracellulaires du récepteur CXCR4 et internalisation ultérieure du récepteur.
La dose de porteurs et de matériel génétique est déterminée individuellement et dépend du type de cellules, de la quantité de récepteur CXCR4 à leur surface et de la complexité de transfection de ces cellules.
Pour augmenter l'efficacité de ces supports, la transfection cellulaire est réalisée de préférence à l'aide d'un agent endosomolytique. Il s'agit notamment du glycérol, de la chloroquine, etc. Ces substances sont ajoutées au milieu de transfection immédiatement avant d'ajouter les complexes aux cellules. Ils restent indépendants des complexes et n’affectent donc pas leur structure.
Des peptides, d'autres composés polymères et des liposomes capables de compacter les acides nucléiques peuvent être utilisés comme partie de liaison à l'ADN du support. De plus, ils peuvent avoir des propriétés endosomolytiques (il n'est pas nécessaire d'utiliser un agent endosomolytique supplémentaire) et, si nécessaire (par exemple, pour la délivrance de gènes thérapeutiques ou marqueurs), délivrer du matériel génétique au noyau.
Lors de la sélection des conditions de transfection, elles sont créées pour garantir la plus grande efficacité de livraison. Il est préférable d'incuber les complexes avec les cellules pendant 4 heures. Vous pouvez toutefois varier ce temps de 3 à 6 heures. Après le temps d'incubation, le milieu est changé et les cellules sont laissées pendant 24 à 48 heures (selon le type cellulaire et le matériel génétique) pour l'expression des constructions introduites avec le gène d'intérêt ou la manifestation de l'effet thérapeutique des oligonucléotides.
L'analyse de l'efficacité de la délivrance est réalisée par des méthodes enzymatiques ou immunohistochimiques, en fonction du type de construction génétique introduite.
Exemple 1. Formation de complexes ADN/porteur et étude du processus de formation du complexe.
Le plasmide pCLUC4, contenant le gène de la luciférase de luciole sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus, a été utilisé comme matériel génétique pour la délivrance ciblée de gènes dans les cellules. Un mode de réalisation du support a été utilisé.
Des solutions de 1 µg d'ADN dans 40 µl de tampon HBM 1X (mannitol à 5 % p/v, Hepes 5 mM, pH 7,5) et des solutions de support correspondant à différents rapports de charge ADN/support ont été préparées dans volume égal tampon. La solution support a été progressivement ajoutée au tube Eppendorf contenant la solution d'ADN et mélangée vigoureusement pendant 20 secondes. Le mélange résultant a été laissé pendant 30 minutes à température ambiante pour achever le processus de formation du complexe.
Les résultats de complexation sont analysés par la méthode de déplacement au bromure d'éthidium. La fluorescence du bromure d'éthidium est mesurée à l'aide d'un lecteur multimode à balayage spectral Varioscan Flash (Thermo, Finlande). Le déplacement du bromure d'éthidium a été observé à une émission de 590 nm (excitation à 544 nm) après ajout du support à l'ADN (20 µg/ml) préincubé avec l'agent intercalant bromure d'éthidium (400 ng/ml). Le déplacement a été calculé à l'aide de la formule (F-Ff)/(Fb-Ff), où Ff et Fb sont respectivement les intensités de fluorescence du bromure d'éthidium en l'absence et en présence d'ADN. Les résultats sont présentés sur la figure 1.
Exemple 2. Réalisation d'une transfection in vitro.
Les cellules HeLa, A172 et CHO ont été ensemencées dans des plaques de culture 48 puits (Nunc) 24 heures avant la transfection à raison de 50 000 cellules par puits contenant 500 µl d'un mélange de culture standard constitué de milieu de culture DMEM (GIBCO), 10 % de bovin fœtal. sérum (GIBCO), 2 mM de glutamine, additionné de pénicilline (50 U/ml), de streptomycine (50 µg/ml) et 1 mM de pyruvate de sodium. Une suspension des complexes a été préparée selon la méthode décrite dans l'exemple 1 à raison de 2 µg d'ADN par puits d'une plaque de culture. 10 minutes avant d'ajouter une suspension de complexes ADN/support, les cellules ont été lavées plusieurs fois avec du DMEM et 500 µl de milieu contenant 15% de glycérol et 1,5% d'éthanol ont été ajoutés dans chaque puits. La transfection a été réalisée en ajoutant une suspension de complexes ADN/support au milieu. Après avoir ajouté les complexes, les plaques avec cellules ont été placées dans un thermostat à une température de 37°C et 5 % de CO 2 pendant 4 heures. Après le temps d'incubation, les cellules ont été lavées avec du DMEM et 500 µl de mélange de culture standard ont été ajoutés à chaque puits. La plaque de culture a été incubée dans un thermostat à une température de 37 °C et 5 % de CO 2 pendant 48 heures, après quoi l'expression du gène marqueur a été détectée.
Exemple 3 : Détection de l'expression du gène de la luciférase après transfection in vitro.
Le milieu a été retiré des plaques de culture et les cellules ont été lavées dans du PBS 1x (pH 7,2). 80 µl de tampon de lyse (25 MM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8) ont été ajoutés à chaque puits. 50 µl de lysat ont été transférés dans des plaques de polystyrène à parois opaques pour mesurer l'activité luciférase. La mesure a été réalisée à l'aide d'un lecteur multimode à balayage spectral Varioscan Flash (Thermo, Finlande). La mesure a été réalisée en utilisant une solution de mélange flash de luciférase (Tricine 20 mM, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg (OH) 2 × 5 H 2 O, 2,67 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 μM d'ATP, 270 µM d'acétylcoenzyme A, 470 µM de luciférine). Chaque mesure a été effectuée pendant 10 secondes. Les lectures des instruments ont été obtenues en unités de lumière relative (RLU). Les résultats expérimentaux ont été évalués en unités de lumière relative pour 1 mg de protéine totale provenant d'extraits cellulaires dans un puits d'une plaque de culture. Total La protéine dans chaque puits a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage de protéines (Bio-Rad), par rapport à une courbe d'étalonnage de l'albumine sérique bovine. Les résultats sont présentés sur les figures 2, 3, 4.
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Actuellement, environ 40 méthodes différentes pour introduire de l'ADN recombinant dans les cellules sont connues, résolvant le problème de la traversée de la membrane plasmique de différentes manières. Il n'existe pas encore de classification unifiée des méthodes permettant d'introduire de l'ADN recombinant dans les cellules. Chaque auteur de la revue classe à sa manière, peut-être parce que pour de nombreuses méthodes empiriques, le mécanisme permettant de surmonter la membrane n'est pas encore clair, par exemple pour la transformation. Il existe également une incertitude quant à la terminologie, ce qui n’est pas surprenant dans un nouveau domaine scientifique et pratique en développement rapide.
Chaque méthode d'introduction d'ADN étranger dans les cellules présente ses propres caractéristiques, avantages et inconvénients en termes de survie cellulaire, d'efficacité d'administration, de polyvalence et de possibilités techniques de mise en œuvre. Le choix de la méthode dépend du type de cellules hôtes et du type de vecteur utilisé, ainsi que des préférences personnelles et des capacités de l’expérimentateur. Certaines des méthodes les plus connues pour délivrer de l’ADN aux cellules cibles sont décrites en détail ci-dessous.
La transformation dans son sens le plus général est le processus d'introduction d'ADN libre dans une cellule. Dans un sens plus étroit, le terme s'applique principalement aux bactéries, désignant le processus d'absorption de l'ADN recombinant par des cellules compétentes, induit par une transition de phase thermique de la membrane cellulaire. E. coli est l'organisme le plus courant lorsqu'on travaille avec de l'ADN recombinant, et pour garantir l'introduction de l'ADN plasmidique dans les cellules, les cellules sont incubées avec une solution glacée de CaCl2 et d'ADN, puis soumises à choc thermiqueà 42 ° C pendant ~ 1 min.
Apparemment, à la suite d'un tel traitement, une destruction locale de la paroi cellulaire se produit. L'efficacité de la transformation, définie comme le nombre de transformants pour 1 µg d'ADN ajouté,
dans ce cas, il s'agit d'environ 10 000 à 10 000 000. L'efficacité de cette méthode est faible, environ moins de 0,1 % des cellules sont transformées, mais cet inconvénient est compensé par l'utilisation de schémas de sélection permettant d'identifier rapidement les clones souhaités.
Les cellules capables d’absorber l’ADN étranger sont dites compétentes. La proportion de ces cellules dans la population est généralement très faible, mais elle peut être augmentée en utilisant un milieu nutritif spécial, des conditions de culture et des inducteurs chimiques compétents (sélectionnés, en règle générale, de manière empirique). Une étape fréquemment utilisée dans la préparation de cellules compétentes est la production de sphéroplastes - des cellules partiellement ou totalement (protoplastes) dépourvues de paroi cellulaire externe rigide.
C'est par exemple le seul moyen de transformer efficacement de nombreuses bactéries à Gram positif des genres Bacillus, Listeria, Streptomyces, etc. Certaines méthodes de transformation de levure incluent également les étapes d'élimination enzymatique de la paroi cellulaire de levure à l'aide de glucosidases. Pour les organismes résistants aux inducteurs chimiques de compétence ou manquant de compétence naturelle, d’autres systèmes de délivrance d’ADN sont utilisés.
Conjugaison. Il existe des plasmides bactériens (plasmides conjugatifs) qui ont la capacité de créer des contacts intercellulaires, par lesquels ils passent d'une cellule à l'autre. La formation de contacts entre cellules donneuses et receveuses est assurée par les propriétés conjugatives des plasmides, et le transfert d'ADN lui-même est assuré par les propriétés de mobilisation. Dans ce cas, le plasmide conjugatif peut transporter avec lui un vecteur plasmidique régulier situé dans la même cellule.
De cette manière, il est possible de transformer des cellules réceptrices difficiles à transformer par d'autres moyens. Par exemple, le transfert par mobilisation du vecteur navette pAT187 avec une large gamme d'hôtes depuis E. coli vers diverses bactéries à Gram positif (genres Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus, etc.) a été démontré, bien qu'avec une efficacité bien moindre que pour le transfert entre différentes souches d'E. coli.
De plus, la possibilité d'un transfert conjugatif d'ADN de cellules bactériennes vers des cellules animales en culture a été récemment démontrée. Lors du processus de conjugaison, un seul brin du plasmide donneur est transféré, sur lequel le deuxième brin est ensuite synthétisé. Il en résulte que le plasmide transféré par conjugaison n'est pas attaqué par les enzymes de restriction de l'hôte. L'efficacité de cette méthode pour les bactéries est comparable à celle de la transformation.
Infection virale. Pour introduire des vecteurs à base de virus, la voie infectieuse naturelle d'infection de la cellule hôte, qui dépend du type de virus, est largement utilisée.
Méthodes de perforation. L'une des méthodes populaires d'introduction d'acides nucléiques dans les cellules cibles est l'électroporation - création temporaire de pores dans une membrane lipidique bicouche sous une brève influence champ électrique. Il s’agit d’une méthode physique universelle de transformation dont la technique a été développée pour presque tous les types de cellules.
Lorsque vous travaillez avec E. coli, la suspension cellulaire préparée (~ 50 µl) et l'ADN sont placés entre les électrodes et une seule impulsion de courant d'une durée d'environ 4,5 ms à une tension de 1,8 kV est appliquée, la distance entre les électrodes est de 1 mm. Après un tel traitement, l'efficacité de la transformation augmente à 109-1011 pour les petits plasmides (~3-6 kb) et à 106 pour les grands (~135 kb). Des conditions similaires sont utilisées pour introduire le vecteur BAC dans E. coli.
L'effet électroporant d'une décharge haute tension sur une membrane lipidique bicouche semble dépendre de son rayon de courbure. Par conséquent, les petites cellules bactériennes absorbent efficacement l’ADN à une intensité de champ beaucoup plus élevée (12 à 18 kV/cm) que les grandes cellules animales et végétales, qui absorbent efficacement l’ADN à une intensité de champ de 1 à 2 kV/cm. L'électroporation est la méthode la plus simple, la plus efficace et la plus reproductible pour introduire des molécules d'ADN dans les cellules, qui nécessite toutefois un dispositif électroporateur spécial.
Autres méthodes de perforation pour introduire l'ADN dans les cellules : ultrasons des cellules, grattage des cellules du substrat en présence de matière exogène, centrifugation des cellules dans un milieu contenant de l'ADN en combinaison avec l'électroporation, perforation osmotique de la membrane plasmique, dégradation cellulaire au laser microfaisceau, utilisation de la toxine porogène streptolysine-O.
Transfection. Initialement, ce terme signifiait l'introduction d'ADN viral dans les cellules ; maintenant, sa signification s'est élargie pour désigner l'introduction de tout ADN étranger dans les cellules eucaryotes. Le terme « transformation », qui fait référence au processus d'introduction de l'ADN dans une cellule pour les procaryotes et les levures, s'est avéré peu pratique à utiliser, car par rapport aux cellules animales, la transformation est la transformation de cellules normales en cellules cancéreuses. Au sens étroit, la transfection fait principalement référence à l’introduction d’ADN dans des cellules eucaryotes à l’aide de divers réactifs chimiques.
L’une des premières méthodes développées pour une transfection efficace a été l’incubation de l’ADN avec du DEAE-dextrane. L'efficacité résultante était comparable à la transformation bactérienne et atteignait 106 transfectants par µg d'ADN.
Le mécanisme d'action du DEAE-dextran n'est pas entièrement établi, mais on sait qu'il se lie à l'ADN et à la membrane cellulaire, stimulant la pinocytose (Fig. 2.8), bien qu'il ne soit pas absorbé par les cellules. Les inconvénients de la méthode incluent la toxicité du DEAE-dextrane pour certains types de cellules, la dépendance de l'efficacité sur la qualité du médicament et la très faible fréquence d'obtention de transfectants stables.
Riz. 2.8. Schéma d'introduction de l'ADN faisant partie de divers complexes dans la cellule par endocytose : phagocytose et pinocytose (a). Représentation schématique d'une particule d'un polycation non lipidique sous une dendroforme avec de l'ADN lié, dont la charge négative est compensée par un polymère cationique (b)
L'efficacité de la transfection a été augmentée de 10 à 100 fois en incubant des cellules avec de l'ADN précipité au phosphate de calcium. Les particules denses de précipité d'ADN de calcium sont absorbées par la cellule par phagocytose (Fig. 2.8), mais seule une petite partie des molécules pénétrées atteint le noyau et est intégrée dans l'ADN chromosomique. La méthode au phosphate de calcium est plus efficace et moins chère, mais provoque la rupture des molécules d'ADN, ce qui convertit les molécules circulaires en une forme linéaire, parfois non infectieuse en cas de transfection virale. De plus, les conditions de transfection au phosphate de calcium doivent être sélectionnées individuellement pour chaque cellule cible.
Lors de la recherche d'autres réactifs de transfection, il a été découvert que les molécules de polymère portant une charge cationique en excès peuvent augmenter considérablement l'efficacité de la transfection. Les cations polymères forment des complexes stables avec des charges neutralisées avec des acides nucléiques, capables de transporter l'ADN et l'ARN dans la cellule avec une grande efficacité, les protégeant de l'action des endonucléases sur le chemin vers le noyau (Fig. 2.9).
Riz. 2. 9. Schéma de transport de l'ADN dans le noyau cellulaire dans le cadre d'un complexe polycation-ADN lié à un ligand spécifique par endocytose médiée par le ligand
Les cations polymères synthétiques non lipidiques de conformation linéaire ou ramifiée (forme dendritique) peuvent condenser l'ADN et l'ARN en particules relativement petites, qui se lient ensuite à la membrane cellulaire et pénètrent dans la cellule par endocytose non spécifique. Actuellement, pour la transfection du groupe des polycations non lipidiques, la polyéthylèneimine, les polyamidoamines et les dendrimères à base de celles-ci, des protéines cationiques telles que la polylysine, la protamine et les histones, ainsi que divers Produits commerciaux, par exemple PAMAM.
La révolution a été l'introduction dans la pratique du premier lipide cationique peu toxique DOTMA (1,2-dioleyl-3-N,N,N-triméthylaminopropane), synthétisé par Feigner (1987) et al. L'efficacité de la transfection utilisant le lipide cationique (Fig. 2.10) était environ 100 fois supérieure à celle de tout autre réactif chimique, avec une proportion élevée de cellules transgéniques stables.
Riz. 2. 10. Structure du complexe avec l'ADN (a) et structure générale du polymère lipidique cationique (b). Les polymères lipidiques cationiques (linéaires et ramifiés), similaires en structure et en propriétés aux phospholipides de la membrane cellulaire, forment des complexes avec l'ADN sous forme de liposomes cationiques multicouches (a) par simple mélange des réactifs. De tels complexes pénètrent dans la cellule par endocytose ou fusion avec la membrane cellulaire via la partie lipidique.
Dans le même temps, un nouveau terme « lipofection » a été introduit dans la pratique, soulignant la haute efficacité de la transformation génétique des cellules, rapprochant les complexes lipides-cations des particules virales infectieuses.
Fort de ce succès, de nombreuses variantes de ces composés ont été développées (lipofectine, lipofectamine, cellfectine…).
En parallèle, des véhicules d'administration basés sur des liposomes phospholipidiques remplis d'ADN ou d'ARN ont été développés.
De petites sphères de membranes artificielles peuvent fusionner avec les membranes plasmiques des cellules ou sont absorbées par endocytose, libérant ainsi leur contenu dans la cellule. La faible efficacité de la transfection des liposomes a été augmentée par l'introduction de phospholipides dans la structure des liposomes, par exemple la cardiolipine et la phosphatidyléthanolamine, qui, avec les membranes bicouches, forment également des structures micellaires inversées, connues sous le nom de phases cubiques et hexagonales, capables d'initier la transfection membranaire. la fusion.
La méthode des liposomes est assez capricieuse et nécessite une sélection minutieuse de toutes les conditions pour une transfection efficace de cellules spécifiques. De plus, la procédure d’encapsulation, généralement la sonication, endommage souvent les grosses molécules d’ADN.
Une nouvelle étape dans le développement des réactifs de transfection a été le développement d'une délivrance plus efficace et ciblée d'acides nucléiques à des cellules cibles spécifiques en introduisant divers ligands dans la structure des réactifs de transfection synthétiques et des liposomes pour se lier aux protéines des récepteurs membranaires. La présence de tels groupes de ciblage (ligands), reconnus par les récepteurs cellulaires, permet l'utilisation de mécanismes d'endocytose médiés par les ligands (voir Fig. 2.9).
Les protéines et les peptides reconnus par les récepteurs sont utilisés comme ligands ; les oligosaccharides, car à la surface de nombreuses cellules animales se trouvent des lectines - des protéines réceptrices qui les lient spécifiquement ; polysaccharides. Les processus d'interaction avec les cellules de tels complexes de réactifs de transfection d'ADN (ARN) ciblés sont similaires à la pénétration de particules virales dans la cellule.
Actuellement, les sociétés de biotechnologie proposent une large gamme de réactifs de transfection différents - du plus simple et le moins cher aux derniers développements spécialisés pour différents types cellules et tâches. La création de nouveaux réactifs de transfection encore plus efficaces est également en cours.
Microinjection - la membrane cellulaire est percée avec une micro-aiguille et une solution contenant de l'ADN est injectée dans le cytoplasme de la cellule ou directement dans le noyau si le noyau est suffisamment gros (par exemple, le noyau d'un œuf). La microinjection d'ADN dans les cellules de mammifères est devenue possible avec l'avènement d'un dispositif de production de micropipettes d'un diamètre de 0,1 à 0,5 μm et d'un micromanipulateur. La méthode est très efficace ; la proportion de cellules avec une intégration et une expression stables des gènes injectés peut atteindre 50 %. L'avantage de la méthode décrite est également qu'elle vous permet d'introduire n'importe quel ADN dans n'importe quelle cellule et qu'aucune pression sélective n'est requise pour maintenir le gène introduit dans les cellules.
La transfection balistique, biobalistique ou biolistique (bombardement de microparticules), est basée sur le bombardement de cellules avec des microsphères d'environ 1 à 2 microns recouvertes d'ADN. Des microparticules d'or, de tungstène (parfois phytotoxiques), de silicone et diverses nanosphères synthétiques sont utilisées. Les microparticules recouvertes d'ADN traversent les couches cellulaires et transfèrent la construction génétique directement dans les organites et les noyaux cellulaires. Le « pistolet à gènes » ou « pistolet à gènes » créé à cet effet, développé par J. Sanford en 1987 pour introduire de l'ADN dans les grains de céréales, est de conception similaire aux pistolets à air ( Fig. 2.11).
Riz. 2.11. Introduction d'ADN recombinant dans les feuilles de plantes à l'aide d'un « pistolet à gènes » réutilisable de Bio-Rad (a) et son schéma général (b). Une impulsion d'hélium éjecte les microparticules recouvertes d'ADN ou d'ARN de la capsule d'échantillon. Les microparticules transportant l'ADN sont accélérées et concentrées pour une pénétration maximale dans les cellules, se déplaçant le long du canal d'accélération et le long du canon du pistolet, tandis qu'à la large sortie, le flux d'hélium diverge de manière diffuse vers les côtés. Le filtre d'espacement maintient la distance d'engagement optimale de la cible tout en maximisant l'élimination de l'hélium afin de minimiser les effets dommageables sur les surfaces cellulaires.
La profondeur de pénétration des microparticules est généralement faible - jusqu'à 1 mm. Toutefois, dans des conditions de cuisson particulières, les microparticules peuvent pénétrer dans les tissus jusqu'à une profondeur de 4 à 5 mm et transférer des gènes, par exemple dans les fibres des muscles striés. . La transfection balistique est très efficace même lorsque les parois cellulaires épaisses (levures, plantes) constituent un obstacle à de nombreuses autres méthodes d'administration, et est utilisée également sur des tissus, des organes et même des organismes entiers. Actuellement largement utilisé en thérapie génique pour produire des animaux et des plantes transgéniques.
Cette diversité d'outils et de méthodes de transfection est due à des tâches différentes, à un large éventail de cellules cibles utilisées et de types d'acides nucléiques délivrés aux cellules, ainsi qu'aux besoins de la société d'obtenir toujours plus d'acides nucléiques. des moyens efficaces transmission d'informations génétiques aux cellules, aux tissus et aux organismes entiers. Une attention particulière est accordée au développement de réactifs et de méthodes de transfection en raison des perspectives passionnantes de la thérapie génique humaine, qui nécessite des méthodes ciblées, hautement efficaces et des moyens sûrs livraison de gènes.
Introduction stable et transitoire d'ADN étranger dans la cellule. Après avoir introduit de l'ADN recombinant dans une cellule eucaryote, seul celui-ci petite partie aboutit dans le noyau, puisque la membrane nucléaire constitue une barrière difficile à l’ADN étranger. Dans le noyau, l'ADN recombinant peut être intégré au chromosome ou exister pendant un certain temps à l'état extrachromosomique.
En conséquence, une transfection stable se distingue lorsque l'ADN recombinant est intégré dans les chromosomes des cellules réceptrices et devient leur partie intégrante, ainsi que la transfection temporaire ou transitoire, dans laquelle des molécules d'ADN recombinant existent et sont transcrites dans les noyaux dans un état extrachromosomique pendant une courte période. L'héritage stable de l'ADN étranger introduit est la principale condition pour l'obtention d'organismes transgéniques à des fins économiques.
Par conséquent, le développement de méthodes d'introduction d'ADN dans des cellules conduisant à l'obtention d'une plus grande proportion de transformants stables est proposé. Attention particulière. De plus, un pourcentage important de transformants stables permet également d'abandonner les gènes sélectifs et marqueurs, qui sont un lest dans la création d'organismes transgéniques.
SUR LE. Voinov, T.G. Volova
Introduction
1 Principaux groupes d'enzymes génétiquement modifiées
1.1 Enzymes de restriction
1.1.1 Mécanisme d'action des enzymes de restriction
1.1.2 Construction de cartes de restrictions
1.3 Ligasses
2 Introduction d'un nouveau gène dans une cellule
2.1 Régulation de l'expression des gènes chez les procaryotes
2.2 Méthodes pour introduire directement un gène dans une cellule
2.3 Introduction de gènes dans les cellules de mammifères
2.4 Transformation génétique des cellules somatiques de mammifères
2.5 Thérapie génique
2.6 Production d'animaux transgéniques
Conclusion
Bibliographie
Introduction
Le génie génétique est la construction in vitro de structures génétiques fonctionnellement actives (ADN recombinant), ou en d'autres termes, la création de programmes génétiques artificiels (Baev A. A.). Selon E. S. Piruzyan, le génie génétique est un système de techniques expérimentales qui permettent de construire en laboratoire (in vitro) des structures génétiques artificielles sous la forme de molécules d'ADN dites recombinantes ou hybrides.
Nous parlons de la construction dirigée, selon un programme prédéterminé, de systèmes génétiques moléculaires en dehors du corps avec leur introduction ultérieure dans un organisme vivant. Dans ce cas, l'ADN recombinant devient partie intégrante appareil génétique de l'organisme receveur et lui confèrent de nouvelles propriétés génétiques, biochimiques puis physiologiques uniques.
L'objectif du génie génétique appliqué est de concevoir de telles molécules d'ADN recombinant qui, une fois introduites dans l'appareil génétique, conféreraient à l'organisme des propriétés utiles à l'homme.
La technologie de l'ADN recombinant utilise les méthodes suivantes :
Clivage spécifique de l'ADN par des nucléases de restriction, accélérant l'isolement et la manipulation de gènes individuels ;
Séquençage rapide de tous les nucléotides dans un fragment d'ADN purifié, qui permet de déterminer les limites du gène et la séquence d'acides aminés codée par celui-ci ;
Construction d'ADN recombinant ;
L'hybridation d'acides nucléiques, qui permet la détection de séquences spécifiques d'ARN ou d'ADN avec une plus grande précision et sensibilité, en fonction de leur capacité à se lier à des séquences d'acides nucléiques complémentaires ;
Clonage d'ADN : amplification in vitro par réaction en chaîne par polymérase ou introduction d'un fragment d'ADN dans une cellule bactérienne qui, après cette transformation, reproduit ce fragment en millions de copies ;
Introduction d'ADN recombinant dans des cellules ou des organismes.
Histoire du génie génétique
Le génie génétique est apparu grâce aux travaux de nombreux chercheurs dans diverses branches de la biochimie et de la génétique moléculaire. Pendant de nombreuses années, les protéines ont été considérées comme la principale classe de macromolécules. On pensait même que les gènes étaient de nature protéique. Il faudra attendre 1944 pour qu’Avery, McLeod et McCarthy démontrent que l’ADN est porteur d’informations héréditaires. À partir de ce moment, une étude intensive des acides nucléiques a commencé. Une décennie plus tard, en 1953, J. Watson et F. Crick créèrent un modèle d'ADN double brin. Cette année est considérée comme l’année de naissance de la biologie moléculaire.
Au tournant des années 50 et 60, les propriétés du code génétique sont clarifiées et, à la fin des années 60, son universalité est confirmée expérimentalement. Il y a eu un développement intensif de la génétique moléculaire, dont les objets étaient E. coli, ses virus et ses plasmides. Des méthodes ont été développées pour isoler des préparations hautement purifiées de molécules d'ADN, de plasmides et de virus intacts. L'ADN des virus et des plasmides a été introduit dans les cellules sous une forme biologiquement active, assurant sa réplication et l'expression des gènes correspondants. Dans les années 70, un certain nombre d’enzymes catalysant les réactions de conversion de l’ADN ont été découvertes. Les enzymes de restriction et les ADN ligases jouent un rôle particulier dans le développement des méthodes de génie génétique.
L’histoire du développement du génie génétique peut être divisée en trois étapes. La première étape consiste à prouver la possibilité fondamentale d’obtenir des molécules d’ADN recombinant in vitro. Ces travaux concernent la production d'hybrides entre différents plasmides. La possibilité de créer des molécules recombinantes en utilisant les molécules d'ADN originales de divers types et les souches bactériennes, leur viabilité, leur stabilité et leur fonctionnement.
La deuxième étape est associée au début des travaux sur l'obtention de molécules d'ADN recombinant entre les gènes chromosomiques des procaryotes et divers plasmides, prouvant leur stabilité et leur viabilité.
La troisième étape est le début des travaux sur l'inclusion de gènes eucaryotes, principalement animaux, dans des molécules d'ADN vecteur (ADN utilisé pour le transfert de gènes et susceptible d'être intégré dans l'appareil génétique de la cellule réceptrice).
Formellement, la date de naissance du génie génétique doit être considérée comme 1972, lorsqu'à l'Université de Stanford, P. Berg, S. Cohen, H. Boyer et leurs collègues ont créé le premier ADN recombinant contenant des fragments d'ADN du virus SV40, du bactériophage et d'E. coli. .
1 Principaux groupes d'enzymes génétiquement modifiées
Le génie génétique est un descendant de la génétique moléculaire, mais il doit sa naissance aux succès de l'enzymologie génétique et de la chimie des acides nucléiques, les enzymes étant les outils de manipulation moléculaire. Bien que nous puissions parfois travailler avec des cellules et des organites cellulaires à l’aide de micromanipulateurs, même les plus petits instruments microchirurgicaux ne seront d’aucune utilité lorsque nous travaillerons avec des macromolécules d’ADN et d’ARN. Ce qu'il faut faire? Les enzymes agissent comme un « scalpel », des « ciseaux » et un « fil à coudre ».
Eux seuls peuvent retrouver certaines séquences nucléotidiques, y « couper » une molécule ou, à l'inverse, « colmater » un trou dans une chaîne d'ADN. Ces enzymes travaillent depuis longtemps dans les cellules, effectuant des travaux sur la réplication (doublement) de l'ADN lors de la division cellulaire, la réparation des dommages (restauration de l'intégrité de la molécule), dans les processus de lecture et de transfert d'informations génétiques de cellule à cellule ou à l'intérieur. une cellule. La tâche d'un ingénieur généticien est de sélectionner une enzyme qui remplirait les tâches assignées, c'est-à-dire qui serait capable de travailler avec une certaine section d'acide nucléique.
Il convient de noter que les enzymes utilisées en génie génétique manquent de spécificité d'espèce, de sorte que l'expérimentateur peut combiner des fragments d'ADN de n'importe quelle origine dans la séquence de son choix en un seul tout. Cela permet au génie génétique de surmonter les barrières entre espèces établies par la nature et de réaliser des croisements interspécifiques.
Les enzymes utilisées dans la construction de l’ADN recombinant peuvent être divisées en plusieurs groupes :
Enzymes qui produisent des fragments d’ADN (enzymes de restriction) ;
Enzymes qui synthétisent l'ADN sur une matrice d'ADN (polymérases) ou d'ARN (transcriptases inverses) ;
Enzymes qui relient les fragments d'ADN (ligases) ;
Enzymes qui permettent des modifications dans la structure des extrémités des fragments d'ADN.
1.1 Enzymes de restriction
Il est généralement admis que les termes « enzyme de restriction », « endonucléase de restriction » et « endodésoxyribonucléase spécifique d'un site » sont synonymes.
Toutes les endonucléases de restriction bactériennes reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques, plutôt courtes, et s'y lient. Ce processus s'accompagne d'une coupure de la molécule d'ADN soit au site de reconnaissance lui-même, soit à un autre site, déterminé par le type d'enzyme. Parallèlement à l'activité de restriction, la souche bactérienne a la capacité de méthyler l'ADN ; Ce processus est caractérisé par la même spécificité de séquence d'ADN que la restriction. La méthylase ajoute des groupes méthyle aux résidus adénine ou cytosine au même site où se lie l'enzyme de restriction. Suite à la méthylation, le site devient résistant à la restriction. Par conséquent, la méthylation empêche l’ADN d’être coupé.
Il existe 3 grandes classes d’enzymes de restriction : 1, 2 et 3.
Toutes les enzymes de restriction reconnaissent des séquences strictement définies sur l'ADN double brin, mais les enzymes de restriction de classe 1 effectuent des cassures à des points arbitraires de la molécule d'ADN, et les enzymes de restriction de classes 2 et 3 reconnaissent et clivent l'ADN à des points strictement définis dans les sites de reconnaissance ou à un emplacement fixé à leur distance.
Les enzymes des types 1 et 3 ont une structure de sous-unités complexe et ont deux types d'activités : l'endonucléase modificatrice (méthylante) et dépendante de l'ATP.
Les enzymes de classe 2 sont constituées de 2 protéines distinctes : une endonucléase de restriction et une méthylase modificatrice. Par conséquent, seules les enzymes de classe 2 sont utilisées en génie génétique ; Ils nécessitent des ions magnésium comme cofacteurs.
Actuellement, plus de 500 enzymes de restriction de classe 2 ont été isolées, mais parmi les enzymes isolées de divers micro-organismes, certaines reconnaissent les mêmes séquences sur l'ADN. Ces paires ou groupes sont appelés isoschizomères. Une distinction est faite entre la vraie isoschisomérie, lorsque les enzymes reconnaissent la même séquence nucléotidique et brisent l'ADN aux mêmes points, et la fausse, lorsque les enzymes, reconnaissant le même site sur l'ADN, produisent des cassures en différents points du même site.
La plupart des enzymes de restriction de classe 2 reconnaissent les séquences contenant de 4 à 6 paires de nucléotides, c'est pourquoi les enzymes de restriction sont divisées en petites et grandes coupes. Les enzymes de restriction à petite section reconnaissent les tétranucléotides et introduisent beaucoup plus de cassures dans les molécules que les enzymes de restriction à grande section, qui reconnaissent une séquence de six paires de nucléotides. Cela est dû au fait que la probabilité d'apparition d'une certaine séquence de quatre nucléotides est bien supérieure à celle d'une séquence de six nucléotides. Par exemple, l'ADN du bactériophage T7, constitué de 40 000 paires de bases, est dépourvu d'une séquence reconnue par l'enzyme de restriction R1 d'E. coli.
Les enzymes de restriction Hpa II et Alu (d'Arthrobacter luteus) sont des enzymes à petite division, et Eco R I (d'Escherichia coli) et Hind III sont des enzymes à grande division. Si nous supposons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction sont répartis de manière aléatoire le long de la chaîne d'ADN, alors la cible pour les enzymes reconnaissant une séquence (site) de quatre nucléotides devrait apparaître en moyenne une fois toutes les 256 paires de bases, et pour les enzymes reconnaissant six nucléotides - toutes les 4096 bases. paires. Si le site de restriction se trouve à l’intérieur du gène, le traitement avec une enzyme de restriction de l’ADN conduira à son inactivation. La probabilité d'un tel événement est très élevée lors d'un traitement avec des enzymes de restriction de petite taille et insignifiante lors de l'utilisation d'endonucléases de grande taille. Ainsi, afin d'obtenir un gène intact, le clivage est effectué alternativement avec plusieurs enzymes de restriction de grande taille, ou la technique de « sous-restriction » est utilisée, c'est-à-dire la restriction est effectuée dans des conditions dans lesquelles le clivage se produit sur un seul site.
1.1.1 Mécanisme d'action des enzymes de restriction
Des palindromes de 4 à 6 paires de bases - sites de restriction - font souvent office de cibles (sites de reconnaissance). Les points de reconnaissance par les enzymes de restriction sont symétriques par rapport à une rotation de 180°C, c'est-à-dire que la séquence des nucléotides de gauche à droite dans un brin est la même que de droite à gauche dans l'autre. La symétrie signifie que ceux qui doivent être méthylés se trouvent sur les deux brins d’ADN. En conséquence, le site cible peut être entièrement méthylé (les deux chaînes sont modifiées), semi-méthylé (une seule chaîne est méthylée) ou non méthylé.
Un site entièrement méthylé n’est soumis ni à une restriction ni à une modification. Un site hémiméthylé n'est pas reconnu par une enzyme de restriction, mais peut être converti en site entièrement méthylé par une méthylase. Chez les bactéries, la méthylation est généralement associée au maintien de l’état de modification existant. La réplication de l'ADN entièrement méthylé conduit à la formation d'ADN hémiméthylé. Il est probable que la reconnaissance des sites hémiméthylés soit une étape normale dans le fonctionnement de la méthylase in vivo.
Le site cible non méthylé fournit un substrat pour une restriction ou une modification in vitro. Dans une cellule, l’ADN non modifié est plus susceptible d’être restreint. La réaction de découpe s'effectue en deux étapes. Tout d’abord, un brin d’ADN est coupé, puis un autre à proximité. Dans les régions adjacentes de chaque côté du site de coupe, une dégradation exonucléotique peut se produire. Il se produit une hydrolyse efficace de l'ATP, dont le rôle n'a pas encore été clarifié.
Comment l’enzyme reconnaît-elle un site et en coupe-t-elle un autre, assez éloigné ? Il est important de noter que la protéine ne se sépare jamais de la molécule d’ADN à laquelle elle s’est initialement liée. Si l’enzyme est incubée avec un mélange d’ADN modifié et non modifié, elle coupe préférentiellement l’ADN non modifié. Par conséquent, lors de la reconnaissance du site de liaison, la protéine ne se sépare pas de l’ADN non méthylé afin de trouver le site de coupe.
Il existe deux modèles alternatifs qui expliquent la relation entre les sites de reconnaissance et de coupure : selon l'un, l'enzyme se déplace, selon l'autre, l'ADN se déplace. Si l'enzyme se déplace, son mouvement le long de l'ADN se poursuivra jusqu'à ce qu'elle choisisse un site de coupure. Si l'ADN se déplace, l'enzyme reste attachée au site de reconnaissance et l'ADN est tiré via un deuxième site de liaison sur l'enzyme, et cela continue jusqu'à ce que l'enzyme atteigne la région de coupure (non encore caractérisée). Des données au microscope électronique ont été obtenues indiquant que l'enzyme provoque la formation d'une boucle dans l'ADN et semble rester associée au site de reconnaissance après coupure ; ces données soutiennent le deuxième modèle.
1.1.2 Construction de cartes de restrictions
Les enzymes de restriction sont devenues un outil de recherche efficace. Ils permettent de convertir de très grosses molécules d’ADN en un ensemble de fragments allant de plusieurs centaines à plusieurs milliers de bases. En utilisant l'électrophorèse sur gel d'agarose (voir section 1), des fragments d'ADN de différentes tailles peuvent être facilement séparés, puis chaque fragment peut être examiné séparément.
Les fragments courts migrent beaucoup plus rapidement que les fragments longs. À une concentration relativement élevée d’agarose, les gros fragments ne peuvent pas du tout pénétrer dans le gel. Lors de la migration, les fragments de restriction ne se dégradent pas ; ils peuvent être élués (lavés) sous forme de molécules double brin biologiquement actives. La coloration des gels avec des colorants liant l'ADN révèle un ensemble de bandes, chacune correspondant à un fragment de restriction, dont le poids moléculaire peut être déterminé par calibrage avec de l'ADN de poids moléculaires connus.
La comparaison des tailles des fragments d'ADN obtenus après traitement d'une certaine région du génome avec un ensemble de nucléases de restriction permet de construire une carte de restriction, qui indique la position de chaque site de restriction par rapport aux autres régions.
Une molécule d'ADN longue de 5 000 paires de nucléotides (pb). traités séparément avec les enzymes de restriction A et B. Les fragments sont séparés par électrophorèse. L'enzyme A coupe l'ADN en 4 fragments de 2100, 1400, 1000 et 500 pb. Le traitement avec l'enzyme de restriction B a donné 3 fragments : 2 500, 1 300 et 1 200 pb. (Fig. 37). Pour déterminer l'emplacement des sites de restriction de ces enzymes, l'étape suivante consiste à utiliser une procédure de double clivage : l'ADN est traité avec deux endonucléases. Le traitement simultané du fragment étudié avec deux enzymes de restriction a donné 6 fragments : 1 900, 1 000, 800, 600, 500, 200 pb.
Riz. 1. Résultats de l'électrophorèse après traitement d'un fragment d'ADN avec diverses enzymes de restriction
L'option la plus complète consiste à éluer chaque fragment résultant de la digestion avec une enzyme de restriction puis à le traiter avec une seconde. Le mélange de fragments obtenu après ce traitement est également analysé par électrophorèse. Dans notre exemple, les résultats suivants ont été obtenus :
Traitement de chacun des 4 fragments A avec l'enzyme de restriction B
21h00 - 19h00 et 200h,
14h00 - 800 et 600,
500 - 500 (aucun changement)
Traitement de chacun des 3 fragments B avec l'enzyme de restriction A
2500 - 1900 et 600
13h00 - 800 et 500
1200 - 1000 et 200
L'analyse des résultats montre que chacune des enzymes obtenues par digestion de fragments A avec l'enzyme de restriction B peut être trouvée dans des échantillons obtenus par digestion de fragments B avec l'enzyme de restriction A. La clé de la cartographie de restriction réside dans le chevauchement des fragments. Dans l'exemple considéré, il s'agit du fragment B 2100 et du fragment A 2500. Lorsqu'ils sont traités avec une autre enzyme de restriction, ils donnent le fragment 1900.
A partir des données sur le clivage de ces fragments, nous supposons que d'un côté, à une distance de 200 pb. à partir du fragment 1900 se trouve le site A suivant, et à l'autre extrémité, à une distance de 600 pb. – site B suivant (Fig. 38). Lorsqu'il est traité avec deux endonucléases, un fragment de 200 pb. se forme une seule fois, lorsqu'il est traité avec l'enzyme de restriction A à partir du fragment B 1200, c'est-à-dire que le fragment 1200 se trouve à gauche. Reste à déterminer comment la carte continue vers la droite. Évidemment, il s'agit d'un fragment A 1400, puisqu'il est coupé par l'enzyme de restriction B en fragments 600 et 800. À droite du fragment 2500, il faut évidemment placer le fragment 1300. Il est alors logique qu'il y ait un fragment A. 500 et division du fragment B 1300 par l'enzyme de restriction A en 800 et 500.
Lors de la construction de cartes de restriction, plusieurs enzymes de restriction sont généralement utilisées, il est donc nécessaire d'analyser les relations complexes entre les fragments obtenus par l'action de différentes enzymes. Pour simplifier la procédure de mappage, un fractionnement incomplet peut être utilisé. Dans certaines conditions, une enzyme de restriction ne reconnaît pas et ne clive pas tous les sites de la molécule d'ADN. Par exemple, lorsque l’ADN est partiellement digéré par l’enzyme A, des fragments de 3 100 et 1 400 pb peuvent être formés. et 500 pb En les comparant avec les données de fractionnement complet (2100, 1400, 1000 et 500), on peut immédiatement mettre 2100 et 1000 l'un à côté de l'autre (fragment 3100). Et ayant reçu un fragment de 3500, place 2100 pb à proximité. et 1400 pb
Riz. 2. Analyse des fragments de restriction et carte des fragments d’ADN
Une autre technique consiste à introduire une étiquette terminale radioactive. Les fragments terminaux sont déterminés dans ce cas par l'inclusion d'un marqueur. Les fragments peuvent également être mis en correspondance par hybridation d'acide nucléique. Les fragments superposés (dans ce cas 2100 et 2500) s'hybrideront.
La première carte a été obtenue pour le virus SV40 (virus simien provoquant une transformation maligne), contenant 5423 paires de bases. L'enzyme de restriction Hind-II a été utilisée, qui divise l'ADN circulaire du virus en 11 fragments. L’ordre de leur disposition dans l’ADN a été établi en examinant les ensembles de fragments formés au fur et à mesure du clivage. La première cassure a transformé la molécule cyclique en une molécule linéaire, qui s'est ensuite divisée en fragments de plus en plus petits. Des ensembles de fragments superposés ont d'abord été étudiés, puis les produits d'un clivage complet. De cette manière, une carte de restriction de l’ADN viral circulaire a été obtenue, sur laquelle des sites de clivage par des enzymes de restriction ont été appliqués. En répétant des expériences similaires avec une autre enzyme de restriction, on peut obtenir une carte plus détaillée, où de nombreux sites de restriction sont marqués.
Avec de telles informations, il est possible d’identifier des régions biologiquement importantes sur l’ADN. Puisqu'une carte de restriction reflète l'emplacement d'une séquence nucléotidique spécifique dans cette zone, la comparaison de telles cartes pour deux ou plusieurs gènes apparentés nous permet d'évaluer l'homologie entre eux. En analysant les cartes de restriction, il est possible de comparer certaines sections d’ADN de différentes espèces animales sans déterminer leur séquence nucléotidique. Ainsi, par exemple, il a été constaté que les régions chromosomiques codant pour les chaînes d'hémoglobine chez l'homme, les orangs-outans et les chimpanzés sont restées pratiquement inchangées au cours des 5 à 10 millions d'années (depuis la divergence des espèces).
La cartographie des restrictions vous permet de visualiser les changements génétiques importants, tels que les suppressions ou les insertions. Dans ce cas, les fragments de restriction diminuent ou augmentent, ainsi que la disparition ou l'apparition de sites de restriction.
L’une des techniques de cartographie est la prise d’empreintes digitales (« méthode des empreintes digitales » ou ADN-fingerprint). Cela implique l’utilisation d’ensembles désordonnés et incomplets de fragments caractéristiques du génome, même s’il ne le décrit pas complètement.
1.2 Transcriptase inverse
La transcriptase inverse est utilisée pour transcrire l’ARNm dans le brin complémentaire de l’ADN. Lors de l'étude des rétrovirus dont le génome est représenté par des molécules d'ARN simple brin, il a été découvert qu'au cours du développement intracellulaire, le rétrovirus passe par l'étape d'intégration de son génome sous forme d'ADN double brin dans les chromosomes de l'hôte. cellule. En 1964, Temin émet l’hypothèse de l’existence d’une enzyme spécifique du virus, capable de synthétiser de l’ADN complémentaire sur une matrice d’ARN. Les efforts visant à isoler une telle enzyme ont été couronnés de succès et, en 1970, Temin et Mizutani, ainsi que, indépendamment, Baltimore ont découvert l'enzyme souhaitée dans une préparation de virions extracellulaires du virus du sarcome de Rous. Cette ADN polymérase ARN-dépendante est appelée transcriptase inverse, ou révertase.
La révertase des rétrovirus aviaires a été étudiée de manière très détaillée. Chaque virion contient environ 50 molécules de cette enzyme. La transcriptase inverse se compose de deux sous-unités - a (65 kDa) et b (95 kDa), présentes en quantités équimolaires. La transcriptase inverse a au moins trois activités enzymatiques :
1) ADN polymérase, qui utilise à la fois l’ARN et l’ADN comme matrice ;
2) l'activité de la RNase H, qui hydrolyse l'ARN faisant partie d'un hybride ARN-ADN, mais pas l'ARN simple ou double brin ;
3) Activité endonucléase de l'ADN.
Les deux premières activités sont nécessaires à la synthèse de l'ADN viral, et l'endonucléase semble être importante pour l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte. La transcriptase inverse purifiée synthétise l'ADN à partir de matrices d'ARN et d'ADN. Pour commencer la synthèse, la reversetase, comme les autres polymérases, nécessite une courte région double brin (amorce). L'amorce peut être un segment simple brin d'ARN et d'ADN qui, au cours de la réaction, devient lié de manière covalente à la chaîne d'ADN nouvellement synthétisée.
Riz. 3. Schéma de synthèse de copies d'ADN double brin de molécules d'ARN
La transcriptase inverse est principalement utilisée pour transcrire l'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc). La réaction de transcription inverse est réalisée dans des conditions spécialement sélectionnées en utilisant de puissants inhibiteurs de l'activité RNase. Dans ce cas, il est possible d’obtenir des copies d’ADN complètes des molécules d’ARN cibles. Oligo (dT) est utilisé comme amorce pour la transcription inverse des ARNm contenant du poly(A) et pour les molécules d'ARN qui n'ont pas d'extrémités 3"-poly(A), des oligonucléotides synthétisés chimiquement complémentaires à l'extrémité 3" de l'ARN. étudiés sont utilisés. Après la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire sur l'ARNm et la destruction de l'ARN (un traitement alcalin est généralement utilisé), la synthèse du deuxième brin d'ADN est réalisée. Dans ce cas, la capacité de la reversetase à former des épingles à cheveux auto-complémentaires aux extrémités 3" des ADNc simple brin, qui peuvent servir d'amorce, est utilisée.
La matrice est le premier brin d'ADNc. Cette réaction peut être catalysée soit par la réversase, soit par l'ADN polymérase I d'E. coli. Il a été montré que la combinaison de ces deux enzymes permet d'augmenter le rendement en molécules d'ADNc double brin complètes. En fin de synthèse, les premier et deuxième brins d'ADNc restent liés de manière covalente par la boucle en épingle à cheveux qui a servi d'amorce lors de la synthèse du deuxième brin. Cette boucle est coupée par l'endonucléase S1, qui détruit spécifiquement les sections simple brin des acides nucléiques. Les extrémités formées dans ce cas ne sont pas toujours émoussées et, pour augmenter l'efficacité du clonage ultérieur, elles sont réparées pour devenir émoussées à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli. L'ADNc double brin résultant peut ensuite être inséré dans des vecteurs de clonage, propagé dans le cadre de molécules d'ADN hybrides et utilisé pour des recherches ultérieures.
1.3 Ligasses
En 1961, Meselson et Weigle, en utilisant le phage I comme exemple, ont montré que la recombinaison implique la rupture puis la réunification des molécules d'ADN. C'est ainsi que commence la recherche d'une enzyme impliquée dans la réticulation des fragments d'ADN. En 1967, une telle enzyme a été découverte et appelée ADN ligase. Il catalyse la synthèse d'une liaison phosphodiester dans une molécule d'acide nucléique à 2 brins.
En d’autres termes, les ADN ligases réticulent les nucléotides adjacents, formant ainsi une liaison entre les résidus sucre. Les ADN ligases sont absolument nécessaires dans les processus de réparation de l'ADN, dans les processus de réplication - lors du doublement du brin d'ADN.
Il existe 2 types d'ADN ligases, qui diffèrent par leurs exigences en matière de cofacteurs et leur mode d'action. L'ADN ligase d'E. coli utilise le nucléotide diphosphopyridine comme cofacteur, et la ligase du phage T4 utilise l'ATP en présence de Mg2+. La ligase du phage T4 est plus universelle, car en plus de ligaturer les extrémités collantes, elle est capable de catalyser la réaction de jonction de fragments d'ADN double brin avec des extrémités franches. Il est utilisé plus souvent.
2 Introduction d'un nouveau gène dans une cellule
Un gène recombinant peut être introduit dans une cellule de 2 manières : à l'aide de vecteurs ou par introduction directe.
Exigences relatives à l'ADN vectoriel, sa composition
Le vecteur est une molécule d'ADN ou d'ARN composée de deux composants : la partie du vecteur (porteur) et le gène étranger cloné. La tâche du vecteur est de délivrer l'ADN sélectionné à la cellule réceptrice, de l'intégrer dans le génome, de permettre l'identification des cellules transformées et d'assurer une expression stable du gène introduit.
Ainsi, le vecteur doit être petit, capable d'être maintenu dans la cellule hôte (répliqué), copié plusieurs fois (amplifié), exprimer le gène correspondant (contenir les séquences régulatrices appropriées), doit avoir un gène marqueur permettant de distinguer cellules hybrides pour leur sélection efficace ; doit pouvoir être transféré dans la cellule de l'organisme correspondant.
Les séquences régulatrices responsables de l’expression stable des gènes seront discutées plus tard.
On distingue deux groupes de gènes marqueurs qui permettent de distinguer les cellules transformées :
1. Gènes sélectifs responsables de la résistance aux antibiotiques (kanamycine, tétracycline, néomycine…), aux herbicides (chez les plantes). Il peut s'agir de gènes d'auxotrophie pour certains substrats, etc. Le principe principal de fonctionnement d'un tel marqueur est la capacité des cellules transformées à se développer sur un milieu nutritif sélectif avec l'ajout de certaines substances qui inhibent la croissance et la division des cellules normales non transformées.
2. Gènes rapporteurs codant pour des protéines cellulaires neutres, dont la présence dans les tissus peut être facilement testée.
Les gènes rapporteurs les plus couramment utilisés sont la β-glucuronidase (GUS), la protéine fluorescente verte (GFP), la luciférase (LUC) et la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). À ce jour, les gènes les plus couramment utilisés dans cet arsenal sont GUS et GFP et, dans une moindre mesure, LUC et CAT. Actuellement utilisé comme gène rapporteur, GUS est un gène modifié d'Escherichia coli codant pour une β-glucuronidase avec masse moléculaire 68 kD. GUS est actif dans une large gamme de conditions environnementales avec un optimum à pH 5-8 et 37°C. Il peut hydrolyser une large gamme de glucuronides naturels et synthétiques, permettant la sélection de substrats appropriés pour la détermination spectrophotométrique ou fluorométrique de l'activité enzymatique, ainsi que pour la coloration histochimique in situ des tissus (par exemple, bleu). L'enzyme est assez stable : elle résiste à la chaleur (demi-vie à 55°C est d'environ 2 heures) et à l'action des détergents. Il n'y a aucune perte d'activité du GUS pendant le processus de gel-dégel. Dans les protéines chimériques créées par des méthodes de génie génétique, GUS conserve généralement son activité fonctionnelle. Dans les cellules vivantes, la protéine GUS est également très stable et active de plusieurs heures à plusieurs jours.
La GFP (protéine fluorescente verte - protéine fluorescente verte ou protéine de fluorescence verte) a été découverte par Shimomura et al. en 1962 chez la méduse luminescente Aequorea victoria. Le gène GFP a été cloné en 1992 par Prasher et al., et quelques années plus tard, l'utilisation active de ce gène comme gène rapporteur a commencé dans le cadre de travaux sur divers organismes pro- et eucaryotes. Actuellement, le gène GFP est utilisé dans des centaines d’études à travers le monde et leur nombre augmente rapidement. Cette croissance rapide est due à propriétés spéciales Protéine GFP, à savoir sa capacité à émettre une fluorescence dans la région visible (verte) du spectre lorsqu'elle est irradiée par des UV à ondes longues. Cette fluorescence est provoquée directement par la protéine et ne nécessite ni substrats ni cofacteurs pour sa manifestation. Grâce à cette propriété, le gène GFP est un gène rapporteur très prometteur, permettant diverses études intravitales (non destructives) avec des organismes transgéniques.
De nombreux dérivés de la GFP sont collectivement appelés AFP (protéines autofluorescentes). De l'anémone de mer Discosoma sp. Une autre protéine, DsRed, fluorescente à la lumière rouge, a récemment été isolée. Plusieurs protéines fluorescentes similaires ont récemment été isolées par des scientifiques de l'Académie des sciences de Russie à partir de divers polypes coralliens de l'ordre des Anthozoaires. Il peut être très dénaturé haute température, des valeurs de pH extrêmes ou des agents réducteurs puissants tels que Na2SO4. Une fois revenue aux conditions physiologiques, la GFP retrouve largement sa capacité à émettre une fluorescence. Dans les protéines chimériques créées par des méthodes de génie génétique, la GFP conserve généralement son activité fonctionnelle. Dans les cellules vivantes, la protéine GFP est également très stable.
CAT – gènes responsables de la synthèse de la chloramphénicol acétyltransférase (isolés d'Escherihia coli). Cette enzyme catalyse le transfert d'un groupe acétyle de l'acétyl-CoA au chloramphénicol. Elle est déterminée histochimiquement par le changement de couleur des tissus lors de l'ajout du substrat approprié.
LUC - le gène code pour l'enzyme luciférase (clonée à partir de bactéries et de lucioles). Cela fait briller les cellules transformées. L'enzyme bactérienne est constituée de deux sous-unités. Pour déterminer l'activité des enzymes, un équipement spécial est nécessaire - un fluorimètre et une caméra vidéo numérique avec un amplificateur de signal lumineux. L'enzyme perd son activité lorsqu'elle est exposée à des détergents et à des températures élevées. Le remplacement des gènes sélectifs par des gènes rapporteurs lors de la sélection de plantes transgéniques est souvent hautement souhaitable, car la possibilité d'un risque potentiel pour l'environnement et la santé humaine lors de l'utilisation de gènes rapporteurs est pratiquement exclue. Cependant, la portée des gènes rapporteurs va au-delà du simple contrôle de la transgenèse. Un autre objectif, évidemment plus important, des gènes rapporteurs est de révéler (aussi quantitativement que possible) les modèles temporels et spatiaux d’expression d’un gène donné, qu’il soit propre ou étranger. Attacher un gène rapporteur à la seule région promotrice permet d'étudier forme pure"son rôle dans la régulation de l'expression du gène étudié au niveau de la transcription.
Remplacer la région codant pour la protéine du gène par un rapporteur tout en préservant la région codant pour la séquence non traduite de l'ARNm terminal 5" nous permet d'évaluer le rôle de cette séquence dans les processus de transport de l'ARNm du noyau vers le cytoplasme. et lancement de la traduction.
L’une des propriétés les plus importantes d’un gène est sa capacité à s’exprimer. Différents éléments génétiques sont responsables de cette propriété, qu’il faut intégrer dans la molécule vecteur porteuse du gène.
2.1 Régulation de l'expression des gènes chez les procaryotes
De nombreux gènes bactériens sont conçus de telle manière qu’ils sont capables de fonctionner de manière significative. efficacité différente. Chez E. coli par exemple, l'abondance relative de diverses protéines varie très largement (de moins de 0,1 % à 2 %) selon leurs fonctions ; De plus, chaque protéine du chromosome d’E. coli est codée par un seul gène. De telles variations sont dues à l’action du système de contrôle de l’expression des gènes, qui s’effectue principalement au niveau de la transcription de l’ADN. Ainsi, le plus souvent, le niveau d'activité du gène est associé à la quantité d'ARNm synthétisé sur celui-ci, c'est-à-dire à l'activité de l'enzyme ARN polymérase.
Les séquences d'ADN situées avant le début du gène structurel et déterminant le degré d'activité de l'ARN polymérase sont appelées séquences régulatrices. L’une de ces séquences est une région de l’ADN à laquelle se lie l’ARN polymérase. Cette région est appelée un promoteur.
La séquence des bases promotrices détermine la fréquence d'initiation de la synthèse de l'ARNm, et le remplacement d'une base dans cette séquence peut conduire à une diminution de 1 000 fois de la fréquence d'initiation.
Un promoteur peut être fort ou faible. Un promoteur fort initie souvent la synthèse de l'ARNm, un promoteur faible beaucoup moins souvent. En revanche, un promoteur peut être réglementé ou non. Par exemple, le promoteur de la β-lactamase est non régulé mais puissant. L'utilisation de tels promoteurs n'est pas toujours pratique. Le fait est que de grandes quantités de protéines peuvent bloquer la croissance des bactéries. De plus, une transcription excessive de l’ADN recombinant peut interférer avec la réplication du plasmide et celui-ci sera perdu. Il est donc plus pratique d'utiliser des promoteurs forts régulés (inductibles), dont l'inclusion, et donc la synthèse de protéines étrangères, peuvent être réalisées lorsqu'une masse bactérienne importante est obtenue.
Certains vecteurs plasmidiques contiennent un promoteur dont le fonctionnement est régulé par le produit protéique sensible à la température du gène répresseur. La protéine répresseur est active à certaines températures et bloque l'action du promoteur. En élevant la température à 42 °C, vous pouvez « allumer » le promoteur et obtenir rapidement une grande quantité de protéines nécessaires.
Le promoteur Trp de l'opéron tryptophane, qui est régulé par la privation de tryptophane, le promoteur lac de l'opéron lactase, qui est induit par le substrat (lactose), et d'autres sont également utilisés comme promoteurs inductibles.
L'intensité de la transcription de certains gènes de structure peut dépendre de l'efficacité de sa terminaison, notamment de la fréquence à laquelle l'ARN polymérase arrête la synthèse de l'ARN avant d'atteindre ces gènes. Relativement récemment, on a découvert que dans de nombreux opérons d'E. coli qui contrôlent la biosynthèse des acides aminés, il existe une séquence de terminaison entre le promoteur et le premier gène structurel. Dans certaines conditions, un signal de terminaison se forme, ce qui affaiblit l'intensité de la transcription.
Ce phénomène est appelé atténuation, et la section d'ADN est appelée atténuateur (atténuateur). Comme la répression, l’atténuation dépend de la présence d’acides aminés appropriés dans l’environnement. Par exemple, un excès de tryptophane dans les cellules de mutants dépendants du tryptophane déficients en répresseur, seulement 1 molécule d'ARN polymérase sur 10 qui commencent la transcription surmonte l'atténuateur et lit la structure du gène. L'élimination du tryptophane triple l'efficacité de la transcription des gènes. Contrairement à la répression, l’atténuation ne dépend pas de l’acide aminé lui-même, mais du tryptophanyl-ARNt (un acide aminé attaché à l’ARNt correspondant).
L'efficacité de la productivité de l'ADN recombinant est significativement affectée par le nombre de copies de cet ADN par cellule. L'activité totale du gène exprimé augmente avec l'augmentation du nombre de copies du plasmide. Ainsi, en utilisant des plasmides multicopies, il est possible de réaliser une supersynthèse des produits protéiques souhaités. Les vecteurs plasmidiques généralement utilisés (pBR 322, etc.) sont maintenus dans la cellule à raison de 20 à 50 copies. Les chercheurs disposent désormais de plasmides mutants sensibles à la température, capables d'accumuler jusqu'à un à deux mille copies par cellule sans perturber ses fonctions vitales. De cette manière, il est possible d’obtenir une surproduction de gènes plasmidiques par des souches bactériennes surproductrices.
La régulation de l'expression dans E. coli se produit également au niveau de la traduction. Une séquence de bases de 6 à 8 nucléotides de long, située juste avant le codon d'initiation AUG, détermine l'efficacité de la traduction. Cette séquence représente le site de liaison de l'ARNm au ribosome. En règle générale, il est situé à 8 nucléotides du codon d'initiation et son déplacement dans un sens ou dans l'autre peut réduire considérablement l'efficacité de la traduction de l'ARNm correspondant. La région décrite est appelée séquence de Schein-Dalgarno, du nom des chercheurs qui l'ont identifiée pour la première fois.
Entre autres choses, le vecteur doit inclure un gène marqueur permettant la sélection de cellules modifiées. Souvent, les gènes d'enzymes largement répandus dans la nature, modifiant les antibiotiques et inactivant leur action, sont utilisés à des fins sélectives.
Caractéristiques de l'organisation du génome eucaryote
Chez les organismes eucaryotes, le mécanisme de régulation de la transcription est beaucoup plus complexe. Grâce au clonage et au séquençage de gènes eucaryotes, des séquences spécifiques impliquées dans la transcription et la traduction ont été découvertes.
Une cellule eucaryote est caractérisée par :
1. La présence d'introns et d'exons dans la molécule d'ADN.
2. Maturation de l'ARNm - excision des introns et couture des exons.
3. La présence d'éléments régulateurs qui régulent la transcription, tels que : a) promoteurs - 3 types, dont chacun est occupé par une polymérase spécifique. Pol I réplique les gènes ribosomiques, Pol II réplique les gènes structurels des protéines, Pol III réplique les gènes codant pour les petits ARN. Les promoteurs Pol I et Pol II sont situés devant le site d'initiation de la transcription, le promoteur Pol III est au sein du gène de structure ; b) modulateurs - séquences d'ADN qui améliorent le niveau de transcription ; c) amplificateurs - séquences qui améliorent le niveau de transcription et agissent quelle que soit leur position par rapport à la partie codante du gène et l'état du point de départ de la synthèse de l'ARN ; d) terminateurs - séquences spécifiques qui arrêtent à la fois la traduction et la transcription.
Ces séquences diffèrent des séquences procaryotes par leur structure primaire et leur emplacement par rapport au codon d'initiation, et l'ARN polymérase bactérienne ne les « reconnaît » pas. Ainsi, pour l’expression de gènes eucaryotes dans des cellules procaryotes, les gènes doivent être sous le contrôle d’éléments régulateurs procaryotes. Cette circonstance doit être prise en compte lors de la construction de vecteurs d'expression.
2.2 Méthodes pour introduire directement un gène dans une cellule
L'introduction directe d'un gène dans une cellule s'effectue de plusieurs manières :
1. Transfection
2. Microinjection
3. Électroporation
5. Conditionnement en liposomes
6. Pistolet à électrons
Lors de la transfection, l'ADN est adsorbé sur des cristaux de phosphate de calcium (Graham Van der Eb, 1973). Des particules de précipité de calcium se forment. Ils sont absorbés par la cellule par phagocytose.
Pour augmenter l'efficacité de la transformation, un porteur d'ADN non spécifique est ajouté à l'ADN spécifique contenant le gène pour lequel la sélection sera effectuée. En règle générale, l'ADN est prélevé à cet effet à partir de thymus de veau ou de sperme de saumon. Une partie de l’ADN se lie à la membrane et ne pénètre pas dans les cellules. L'ADN est accepté par 15 à 90 % des cellules. Quelques jours après l'administration, une petite proportion de cellules sont capables d'exprimer des gènes étrangers, mais le niveau d'expression chute ensuite et 10-3 à 10-5 cellules subissent une transformation plus ou moins stable.
Le DEAE-dextrane, un polymère qui adsorbe l'ADN, est également utilisé pour la transfection. L'effet d'entrée cellulaire et le temps d'expression sont élevés, mais la fréquence de transformation stable est inférieure à celle obtenue avec un précipité de calcium. La fréquence de transfection est augmentée par choc glycérol (4 minutes dans une solution de glycérol à 15% en tampon HEPES).
N'importe quel gène peut être introduit dans les cellules s'il est préalablement ligaturé avec un marqueur de sélection cloné. Cependant, d’autres études ont montré qu’une ligature en dehors de la cellule n’est pas nécessaire. Les cellules qui absorbent un gène sélectif absorbent également d’autres ADN présents dans le précipité de calcium. Ainsi, en utilisant la méthode de cotransformation, presque n'importe quel segment d'ADN cloné peut être introduit dans des cellules eucaryotes cultivées si cet ADN est inclus avec un marqueur sélectif dans le mélange pour former un précipité de calcium.
Des chromosomes ou des fragments de chromosomes peuvent être utilisés pour la transfection. Les cellules du donneur sont bloquées au stade de la mitose. Les chromosomes mitotiques sont libérés sous l'influence du choc osmotique et de l'homogénéisation. Ils sont purifiés par centrifugation différentielle. Les chromosomes sont déposés à la surface des cellules avec du chlorure de calcium et, après quelques heures, ils sont traités avec un réactif capable de perforer les membranes (par exemple le glycérol).
Pour traiter les cellules receveuses, des préparations de chromosomes grossièrement purifiées sont utilisées, car ce sont les chromosomes qui sont le moins détruits. Le nombre de chromosomes pour traiter 1 cellule est limité. Il est préférable de ne pas utiliser plus de 20 chromosomes pour 1 cellule receveuse, car à des concentrations élevées de chromosomes dans la suspension, ils s'agglutinent. La cellule receveuse contient des fragments de chromosomes du donneur qui peuvent être intégrés dans le génome et se répliquer indépendamment. Des délétions sont souvent observées dans les fragments introduits.
Toutes les cellules ne sont pas capables de transformer l’ADN génomique à haute fréquence. Les fibroblastes humains incorporent efficacement l’ADN plasmidique et incorporent à peine l’ADN génomique.
La microinjection d'ADN dans les cellules de mammifères est devenue possible avec l'avènement d'un dispositif permettant de fabriquer des micropipettes d'un diamètre de 0,1 à 0,5 microns et d'un micromanipulateur (Fig. 45). Ainsi, des plasmides contenant un fragment du virus de l'herpès avec le gène de la thymidine kinase (TK) et le plasmide pBR322 ont été injectés dans des cellules TK et il a été montré que le gène TK pénétrait dans les noyaux et s'y répliquait normalement. La méthode d'introduction de l'ADN par microinjection a été développée au début des années 70 par Anderson et Diakoumacos. En principe, avec un bon équipement, 500 à 1 000 cellules peuvent être injectées en 1 heure, et dans les meilleures expériences, une intégration et une expression stables des gènes injectés sont observées dans 50 % des cellules. L'avantage de la méthode décrite est également qu'elle vous permet d'introduire n'importe quel ADN dans n'importe quelle cellule, et aucune pression sélective n'est requise pour maintenir le gène introduit dans les cellules.
Riz. 4. Introduction de l'ADN par microinjection
L'électroporation repose sur le fait que les impulsions à haute tension augmentent de manière réversible la perméabilité des biomembranes. Les cellules et les fragments d'ADN qui doivent être introduits dans les cellules sont ajoutés au milieu d'électroporation (Fig. 46). Des impulsions haute tension (tension 200 - 350 V, durée d'impulsion 54 ms) traversent le milieu, conduisant à la formation de pores (claquage électrique) dans la membrane cytoplasmique, dont la durée de vie et la taille sont suffisantes pour des macromolécules telles que l'ADN. pénétrer dans la cellule depuis l'environnement extérieur sous l'action des forces osmotiques. Dans le même temps, le volume de la cellule augmente.
L'intensité du champ électrique et la durée de son action, la concentration d'ADN transformateur et les cellules réceptrices pour chaque système cellulaire sont sélectionnées expérimentalement afin d'obtenir un pourcentage élevé d'absorption de l'ADN par les cellules survivantes. Il est montré que dans conditions optimales Par électroporation, le nombre de transformants peut atteindre 80 % des cellules survivantes.
L’électroporation est une méthode physique plutôt que biochimique, et c’est pourquoi elle est largement utilisée. De nombreuses études ont démontré que l’électroporation peut être utilisée avec succès pour introduire des molécules d’ADN dans différents types de cellules, telles que les cellules animales en culture, les protozoaires, les levures, les bactéries et les protoplastes végétaux. L'effet électroporant d'une décharge haute tension sur une membrane lipidique bicouche semble dépendre de son rayon de courbure. Par conséquent, les petites cellules bactériennes absorbent efficacement l’ADN à une intensité de champ beaucoup plus élevée (10 kV/cm ou plus) que les grandes cellules animales et végétales, qui absorbent efficacement l’ADN à une intensité de champ de 1 à 2 kV/cm.
L'électroporation est la méthode la plus simple, la plus efficace et la plus reproductible pour introduire des molécules d'ADN dans les cellules. Cependant, jusqu'à récemment, cette méthode était utilisée dans un nombre limité de laboratoires en raison du manque de dispositifs en série - les électroporateurs. L’émergence et l’amélioration de tels dispositifs dans les années à venir conduiront à l’utilisation généralisée de cette approche en génie génétique sur une grande variété de types cellulaires.
Riz. 5. Méthode d'électroporation
Les « mini-cellules » sont obtenues en bloquant les cellules du donneur de la mitose avec du colcémide. Avec un traitement prolongé des cellules avec du colcémide, une nouvelle membrane nucléaire se forme autour de chaque chromosome. Le traitement à la cytochalasine B et la centrifugation conduisent à la formation de mini-cellules représentant des micronoyaux encapsulés dans la membrane cytoplasmique.
Les mini-cellules résultantes sont très sensibles à diverses sortes influences, c'est pourquoi des conditions douces spéciales sont sélectionnées pour la fusion. La méthode est difficile, capricieuse, peu efficace - 10-6 - 10-7.
Le conditionnement dans des liposomes est utilisé pour protéger le matériel génétique exogène de l'action destructrice des enzymes de restriction.
Les liposomes sont des coquilles sphériques constituées de phospholipides. Ils sont obtenus en agitant fortement un mélange d'une solution aqueuse et de lipides, ou en traitant des émulsions aqueuses de phospholipides aux ultrasons. Les liposomes constitués de phosphatidylsérine et de cholestérol sont les plus appropriés pour introduire de l'ADN dans les cellules animales et végétales. Les systèmes de transfert de liposomes ont une faible toxicité pour les cellules.
La méthode de balistique biologique (biolistique) est aujourd'hui l'une des méthodes les plus efficaces pour transformer les plantes, notamment les monocotylédones.
L'essence de la méthode est que l'ADN vecteur contenant la construction génétique nécessaire à la transformation est pulvérisé sur de minuscules particules de tungstène d'un diamètre de 0,6 à 1,2 microns. Des particules de tungstène portant de l'ADN sont appliquées sur un substrat de cellophane et placées à l'intérieur d'un pistolet biolistique. Les cals ou la suspension cellulaire sont appliqués sur une boîte de Pétri avec un milieu gélosé et placés sous un pistolet biolistique à une distance de 10 à 15 cm. La pression dans le pistolet est réduite à 0,1 atm à l'aide d'une pompe à vide. Au moment où la pression est relâchée, les particules de tungstène sont éjectées du pistolet biolistique à une vitesse énorme et, déchirant les parois cellulaires, pénètrent dans le cytoplasme et le noyau des cellules.
En règle générale, les cellules situées directement au centre meurent en raison du grand nombre et de la pression des particules de tungstène, tandis que les cellules transformées avec le plus de succès sont situées dans la zone située à 0,6-1 cm du centre. Ensuite, les cellules sont soigneusement transférées dans le milieu pour une culture et une régénération ultérieures.
À l’aide d’un pistolet biolistique, des plantes monocotylédones comme le maïs, le riz, le blé et l’orge ont été transformées. Dans ce cas, des plantes transformantes stables ont été obtenues. Outre le succès dans l'obtention de monocotylédones transgéniques, la transformation biolistique est utilisée pour le transfert direct de l'ADN dans le pollen embryogène et la production rapide ultérieure de plantes dihaploïdes transgéniques, qui constituent une étape importante dans le travail de sélection. Actuellement, la transformation des plants de tabac a été réalisée selon ce procédé et, après régénération des plants haploïdes, des transformants stables ont été obtenus.
2.3 Méthodes pour introduire directement un gène dans une cellule
Actuellement, la bactérie E. coli est la cellule la plus étudiée de toutes. Pour la plupart des phages les plus étudiés, la cellule hôte est également E. coli.
Le protoplaste d'E. coli est enfermé dans un sac muréique adjacent à la membrane externe. E. coli fait référence à des micro-organismes qui n'ont pas la compétence physiologique pour absorber l'ADN exogène. Il est donc nécessaire de créer des conditions permettant de surmonter la barrière de la paroi cellulaire. Premièrement, les sphéroplastes sont obtenus en traitant les cellules avec du lysozyme dans une solution isotonique.
La couche de lipopolysaccharides de la membrane externe d'une bactérie à Gram négatif est stabilisée par des cations divalents, de sorte que l'agent complexant acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), qui lie les cations divalents, est utilisé pour desserrer la membrane externe d'E. coli. Lorsqu'ils sont traités avec l'EDTA, certains lipopolysaccharides sont libérés de la membrane externe de la cellule et le lysozyme peut atteindre le sac muréine et l'hydrolyser. Cela conduit à une perméabilité accrue de la membrane cellulaire. Les améliorations des méthodes d'obtention des sphéroplastes d'E. coli et de leur transfection ont permis d'atteindre une efficacité de transformation assez élevée avec des molécules d'ADN de divers phages.
Il a été constaté que le pouvoir infectieux est influencé de manière significative par la forme des molécules d’ADN des phages qu’ils prennent in vivo. Les phages à ADN circulaire ou linéaire, mais à fermeture rapide (phages lamboïdes) se caractérisent par l'efficacité de transfection la plus élevée.
Les expériences réussies sur E. coli sont devenues une incitation à mener des études similaires avec d'autres organismes procaryotes. Le plus grand succès a été obtenu avec les cellules de Bacillus subtilis. B. subtilis est un micro-organisme non pathogène du sol qui se développe dans des conditions strictement aérobies. Les bacilles ne produisent pas de toxines et ne sont pathogènes ni pour les animaux ni pour les humains, tandis que la paroi cellulaire d'E. coli contient une endotoxine, assez difficile à séparer des produits génétiquement modifiés. De plus, la paroi cellulaire des bacilles a une structure simple et les bactéries peuvent sécréter de nombreuses protéines dans le liquide de culture. 20 types différents de bacilles sécrètent plus de 40 enzymes avec localisation extracellulaire dans le liquide de culture. E. coli sécrète relativement peu de protéines dans le milieu et leur isolement et leur purification sont difficiles. Des plasmides et des phages ont également été trouvés dans des bacilles, qui sont désormais bien étudiés.
Les gènes étrangers sont clonés dans ce que l'on appelle des vecteurs navettes. Ces vecteurs se répliquent avec le même succès dans les cellules de plusieurs hôtes, en l'occurrence dans les cellules d'E. coli et de B. subtilis. Les vecteurs ont été obtenus par combinaison in vitro de fragments de ces plasmides.
Les gènes d'E. coli et leurs régions régulatrices ne fonctionnent pas chez B. subtilis, c'est pourquoi les propres régions homologues de B. subtilis ont été utilisées.
Pour construire un ADN recombinant contenant le gène à exprimer, la stratégie suivante est suivie. L'ADNc est synthétisé ou les cellules portant un fragment du génome avec le gène souhaité sont isolées de la bibliothèque de clones et clonées dans le vecteur approprié. Les fragments d'ADN génomique sont modifiés - des régions non codantes et des sections de gènes voisins en sont supprimées. Souvent cette opération nécessite le séquençage de ce fragment d’ADN. Ensuite, des ADN recombinants intermédiaires sont construits dans lesquels le gène est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs bactériens (promoteur, opérateur, point de liaison du ribosome). Ces éléments régulateurs sont isolés de plasmides hybrides conçus spécifiquement comme sources d'éléments régulateurs. La construction résultante est insérée dans un vecteur approprié, par exemple pBR 322, et le gène est exprimé dans la cellule bactérienne.
Cependant, il est plus pratique d'intégrer le gène dans un vecteur d'expression spécial, qui contient déjà des éléments régulateurs qui assurent une expression active après l'introduction du plasmide recombinant dans la cellule bactérienne. De telles régions régulatrices efficaces comprennent, par exemple, le promoteur puissant du gène de la bêta-lactamase (gène de résistance à la pénicilline, partie du plasmide pBR 322). Un certain nombre de gènes, dont le gène de l'insuline, ont été insérés dans le site de restriction Pst I, situé dans la partie structurelle du gène. Le promoteur de ce gène assure une transcription efficace, qui se poursuit jusqu'à ce que l'ARN polymérase atteigne le signal de terminaison du gène inséré.
Un exemple de marquage vectoriel sont les premières expériences avec E. coli, ou plus précisément avec l'un de ses plasmides pBR322, réalisées par Gilbert pour produire de l'insuline. Le plasmide pBR322 contient 2 gènes qui déterminent la résistance à l'ampicilline et à la tétracycline. L'enzyme de restriction PstI clive le plasmide dans la partie médiane du gène codant pour l'enzyme de résistance à l'apicilline. Après clivage du plasmide à ses extrémités à l'aide de la transférase terminale, une séquence de quatre nucléotides avec des résidus guanine a été ajoutée. Ensuite, comme d’habitude, le gène de la proinsuline a été « cousu » à l’aide de ligases, obtenant ainsi de l’ADN recombinant. Le fragment d'ADN intégré au plasmide a perturbé la synthèse de l'enzyme qui détruit l'ampicilline, mais le gène qui confère la résistance à la tétracycline est resté actif. Les cellules d'E. coli ainsi transformées ont synthétisé une protéine hybride contenant des séquences de pénicillase et de proinsuline, de sorte que l'insuline biologiquement active a été obtenue par clivage de la pénicillase et du segment médian de la proinsuline.
En revanche, si un fragment d’ADN étranger est inséré dans l’un des gènes de résistance, ce dernier est inactivé. Par conséquent, l’intégration réussie d’un fragment d’ADN étranger dans l’un de ces gènes est facilement détectée par la disparition de la résistance à cet antibiotique chez les bactéries.
2.4 Introduction de gènes dans les cellules de mammifères
Les manipulations avec des cellules de mammifères peuvent être divisées en 2 grands groupes : les expériences avec des cellules somatiques et les expériences sur la transformation des cellules germinales. Dans ce dernier cas, le résultat final est la production d’organismes transgéniques.
Caractéristiques des vecteurs de transfert de gènes dans les cellules animales
Certains des meilleurs vecteurs pour introduire des informations étrangères dans une cellule animale sont des vecteurs basés sur des rétrovirus, par exemple basés sur le virus de la leucémie murine. Ils assurent un transfert de gènes très efficace et leur intégration stable dans le chromosome des cellules cibles. Fondamentalement, les transformations de cellules animales sont réalisées soit à l'aide de rétrovirus (environ 40 % de toutes les transformations), soit en conditionnant l'ADN dans des liposomes (25 %), moins souvent des adénovirus sont utilisés, car ils peuvent provoquer une forte réponse immunitaire, dans De plus, leur introduction répétée est impossible.
Si le problème de la délivrance d'ADN étranger in vitro a été pratiquement résolu et que sa délivrance aux cellules cibles de divers tissus in vivo a été résolue avec succès (principalement en créant des constructions portant des protéines réceptrices, y compris des antigènes spécifiques à certains tissus), alors d'autres Les caractéristiques des systèmes vectoriels existants - stabilité de l'intégration, expression régulée, sécurité - nécessitent encore de sérieuses améliorations.
Cela concerne tout d’abord la stabilité de l’intégration. Jusqu’à présent, l’intégration dans le génome n’était réalisée qu’à l’aide de vecteurs rétroviraux ou adéno-associés. L'efficacité de l'intégration stable peut être augmentée en améliorant les constructions génétiques telles que les systèmes médiés par les récepteurs, ou en créant des vecteurs épisomiques suffisamment stables (c'est-à-dire des structures d'ADN capables de persister à long terme à l'intérieur des noyaux).
Récemment, une attention particulière a été accordée à la création de vecteurs basés sur des chromosomes artificiels de mammifères (MAC). En raison de la présence des éléments structurels de base des chromosomes ordinaires, ces mini-chromosomes sont conservés longtemps dans les cellules et sont capables de transporter des gènes (génomiques) de taille réelle et leurs éléments régulateurs naturels, nécessaires au bon fonctionnement. du gène, dans le bon tissu et au bon moment. De tels chromosomes artificiels ont déjà été créés pour la levure (YAK), puisque le génome de la levure a été entièrement cartographié.
Pour identifier les cellules modifiées, des marqueurs sont nécessaires. Si les cellules somatiques sont transformées, des marqueurs sélectifs sont généralement utilisés. Axel et ses collègues du Columbia University College of Medicine and Surgery ont ainsi corrigé un défaut génétique dans les cellules de souris. Ils ont pris un fragment d'ADN contenant le gène de la thymidine kinase (TK), dérivé d'un virus de l'herpès, ont mélangé cet ADN avec quelques milligrammes d'ADN porteur de sperme de saumon et ont déposé l'ADN sur une culture de cellules L de souris dans laquelle le gène TK était absent (TK-). Avec une fréquence de 1 sur 100 000, les cellules ont acquis le gène TK, donc sur un milieu sélectif qui ne permettait pas aux cellules TK- de se développer, les cellules TK+ se sont développées et se sont multipliées normalement.
Un autre marqueur sélectionnable, le gène codant pour la dihydrofolate réductase (DHFR), peut être utilisé dans la transformation de lignées cellulaires non mutantes. En raison de l'expression de nombreuses copies de ce gène cellule animale avec le plasmide, il acquiert une résistance à des concentrations élevées de l'inhibiteur enzymatique, et ainsi des transformants peuvent être sélectionnés à des concentrations élevées de l'inhibiteur.
Deux autres vecteurs universels contenant des marqueurs génétiques qui fonctionnent dans les cellules normales ont été développés. Ils sont construits sur le même principe : les gènes procaryotes qui déterminent le phénotype des cellules transgéniques sont connectés à des signaux régulateurs eucaryotes.
L'un des vecteurs consiste en un gène procaryote de résistance à l'antibiotique néomycine, inséré dans la région précoce du génome SV-40. Les cellules eucaryotes sont sensibles à l'analogue de la néomycine G 418, qui est inactivé par le produit génique. Ainsi, les cellules transfectées acquièrent la capacité de croître sur un milieu contenant du G 418.
2.5 Transformation génétique des cellules somatiques de mammifères
Des cultures de cellules de mammifères transformées sont utilisées pour obtenir diverses substances. Bien que les cultures de cellules animales, en particulier lorsqu'elles sont cultivées à grande échelle, soient beaucoup moins économiques que les cultures de levures bactériennes, elles présentent un avantage significatif : la capacité d'effectuer des modifications petites mais très importantes des protéines - produits génétiques de mammifères. Par exemple, pour qu’un certain nombre de protéines fonctionnent efficacement, il est nécessaire d’y attacher des chaînes de molécules glucidiques ou lipidiques. La formation et la fixation de telles chaînes sont un processus courant pour les cellules de mammifères, alors qu'une cellule bactérienne n'est pas capable d'effectuer de telles modifications.
Outre la création de cellules productrices, la transformation des cellules somatiques de mammifères permet d'étudier les mécanismes subtils de régulation de l'expression des gènes et de modifier volontairement l'appareil génétique des cellules animales et, le cas échéant, des cellules humaines, ce qui est d'une grande utilité. importance pour la génétique médicale.
Les cultures de cellules de mammifères peuvent constituer une source efficace pour isoler certains antigènes viraux dans le but d'obtenir des vaccins pour les animaux et les humains. La production de telles cultures de cellules vaccinales est réalisable en utilisant la technologie de l'ADN recombinant et des vecteurs d'expression efficaces pour les cellules de mammifères et humaines. Lors de l'utilisation de vaccins à ADN, ce n'est pas un antigène qui est introduit dans l'organisme, mais un gène codant pour la synthèse de cet antigène. Le gène est inséré dans un plasmide et le plasmide est introduit dans le corps par injection ordinaire.
Les vaccins à ADN ont de bonnes perspectives dans la production animale. La fibre est une protéine de l'enveloppe virale. L'épitope fibreux code pour la synthèse d'anticorps protecteurs. L'une des maladies des oiseaux, le syndrome de réduction de la production d'œufs (DEL), est causée par un virus. Après analyse de l'ADN de ce virus, le gène codant pour la fibre a été isolé, cloné et inséré dans un plasmide. Un vaccin recombinant, une fois introduit dans l’organisme, amènera des fibres d’ADN dans la cellule, la production de protéines virales provoquera la synthèse d’anticorps spécifiques, c’est-à-dire provoquera une réponse immunitaire.
L'avantage de ces vaccins est leur très petit volume - 10 à 50 µg de plasmide suffisent pour immuniser une souris, 200 à 300 µg pour une vache. Le plasmide reste dans l’organisme jusqu’à 1 an. Les vaccins à ADN contre les mycoplasmes, l'agent causal de la tuberculose, de la salmonellose et de la leishmaniose, sont actuellement au stade des essais cliniques.
Le développement d’une tumeur maligne dans le corps supprime généralement le système immunitaire. Le problème est de renforcer le système immunitaire dans son ensemble et d’orienter son action contre les cellules cancéreuses. Des chercheurs de la faculté de médecine d'Ann Arbor (Michigan) ont mis au point une méthode pour lutter contre le cancer. Des gènes codant pour des protéines provenant d'une autre souche de souris ont été introduits dans des cellules tumorales du côlon de souris expérimentales. Cela peut être fait en utilisant des liposomes ou un virus. Après que ces protéines soient apparues à l’extérieur de la membrane cellulaire, le système immunitaire a attaqué ces cellules. 20 % des souris malades se sont rétablies, chez 70 % la tumeur a diminué et dans le groupe témoin, tout le monde est mort. Les lymphocytes se sont battus non seulement contre les cellules tumorales « marquées », mais aussi contre les cellules métastatiques, c'est pourquoi le système immunitaire s'est « réveillé ». Des expériences sont actuellement en cours sur des personnes atteintes d'un cancer de la peau.
2.6 Thérapie génique
Le traitement des maladies à l’aide de gènes est appelé thérapie génique. Il existe aujourd’hui environ 400 projets dans le monde dédiés au traitement par thérapie génique.
Le développement d'un programme de thérapie génique est précédé d'une analyse approfondie de l'expression tissulaire spécifique du gène correspondant, de l'identification du défaut biochimique primaire, de l'étude de la structure, de la fonction et de la distribution intracellulaire de son produit protéique, ainsi que de analyse biochimique processus pathologique. Toutes ces données sont prises en compte lors de l'élaboration du protocole médical approprié.
Les tests de la procédure de correction génique d'une maladie héréditaire sont effectués sur des cultures de cellules primaires du patient, dans lesquelles ce gène est normalement fonctionnellement actif. À l'aide de ces modèles cellulaires, l'efficacité du système de transfert d'ADN exogène sélectionné est évaluée, l'expression de la construction génétique introduite est déterminée, son interaction avec le génome cellulaire est analysée et des méthodes de correction sont développées au niveau biochimique. À l'aide de cultures cellulaires, il est possible de développer un système de délivrance ciblée d'ADN recombinant. Cependant, tester la fiabilité du fonctionnement de ce système ne peut être effectué qu'au niveau de l'organisme entier. Par conséquent, une telle attention dans les programmes de thérapie génique est accordée aux expériences in vivo sur des modèles naturels ou artificiellement obtenus de maladies héréditaires correspondantes chez les animaux.
La correction réussie des défauts génétiques chez ces animaux et l’absence d’effets secondaires indésirables de la thérapie génique constituent la condition préalable la plus importante à l’approbation des essais cliniques. Ainsi, schéma standard La correction génétique d'une anomalie héréditaire comprend une série d'étapes successives. Cela commence par la création d’une construction génétique (exprimée) pleinement fonctionnelle contenant les parties sémantiques (codant les protéines) et régulatrices du gène. À l'étape suivante, le problème du vecteur est résolu, garantissant une délivrance efficace et, si possible, ciblée du gène aux cellules cibles. Ensuite, la transfection (transfert de la construction résultante) dans les cellules cibles est effectuée, l'efficacité de la transfection, le degré de correction du défaut biochimique primaire dans les conditions de culture cellulaire (in vitro) et, surtout, in vivo dans des modèles biologiques animaux sont évalué. Ce n’est qu’après cela que le programme d’essais cliniques pourra commencer.
Il existe deux types de thérapie génique : de remplacement et de correction.
La thérapie de remplacement génique consiste à introduire un gène intact dans une cellule. La copie introduite remplacera la fonction du gène défectueux conservé dans le génome du patient. Tous les essais cliniques menés aujourd’hui impliquent l’introduction de quantités supplémentaires d’ADN dans la cellule.
La thérapie corrective consiste à remplacer le gène défectueux par un gène normal suite à une recombinaison. Cette méthode est actuellement au stade des tests en laboratoire, car son efficacité est encore très faible.
Selon la méthode d’introduction de l’ADN exogène dans le génome du patient, la thérapie génique peut être réalisée soit en culture cellulaire (ex vivo), soit directement dans l’organisme (in vivo). La thérapie génique cellulaire, ou thérapie ex vivo, consiste à isoler et à cultiver des types de cellules spécifiques d'un patient, à y introduire des gènes étrangers, à sélectionner les cellules transfectées et à les réinjecter au même patient.
Un exemple est le traitement de l’immunodéficience combinée. Le déficit immunitaire combiné peut résulter d'un défaut du gène de l'adénosine désaminase. La première tentative de traitement d'un tel patient avec des méthodes de thérapie génique a eu lieu aux États-Unis en 1990. Des lymphocytes T ont été prélevés sur un enfant malade, transformés avec un vecteur rétroviral, introduisant un gène normal d'adénosine désaminase, et les cellules ont été renvoyées au système. corps. L'introduction doit être répétée. Une transformation similaire des cellules souches de la moelle osseuse est plus efficace.
La thérapie génique in vivo repose sur l’introduction directe de séquences d’ADN clonées et conditionnées dans les tissus spécifiques d’un patient. Actuellement, il n’existe aucune méthode publiquement disponible pour cultiver des cellules pulmonaires. Par conséquent, pour les maladies pulmonaires, la seule façon de transmettre un gène étranger est de l’introduire directement dans l’organisme. La mucoviscidose est une maladie pulmonaire héréditaire sévère très courante chez les personnes de race blanche, qui touche par exemple dans les familles d'Europe centrale un nouveau-né sur 2500 et pour laquelle un gène défectueux codant pour une protéine régulatrice de la conductance transmembranaire a été identifié. La pneumonie est la principale manifestation du gène défectueux. Toutes les cellules épithéliales sont touchées. Le principal problème est de savoir comment introduire le gène dans les cellules recouvertes de mucus, ce qui empêche la transformation. Une copie intacte du « gène de la maladie », incluse dans un vecteur adénoviral ou liposome, est administrée sous forme d’aérosol dans les voies respiratoires du patient.
Corriger le trouble avec des mesures progressives dystrophie musculaire Duchenne (une maladie des garçons associée à des anomalies du chromosome X), ils ont essayé d'injecter directement dans l'organisme le gène normal codant pour la protéine de la dystrophie. fibre musculaire, en utilisant soit de l'ADN nu, soit un vecteur adénoviral. D'autres chercheurs ont transplanté des myoblastes chez le patient après correction génétique. L'enfant auparavant immobile a acquis la capacité de bouger ! Malheureusement, dans toutes ces expériences, il n'est possible d'obtenir qu'un effet thérapeutique temporaire et la procédure d'introduction du gène doit être répétée plusieurs fois.
La liste des maladies héréditaires dont on essaie ou envisage de traiter avec des gènes est longue. Il s'agit notamment de la polyarthrite rhumatoïde, de la phénylcétonurie et des maladies associées à un manque d'hormones (insuline, érythropoïétine, hormone de croissance). Dans le cas de l'anémie chronique associée à un déficit en érythropoïétine, sur la base d'expérimentations animales, une approche thérapeutique fondamentalement nouvelle est proposée. Puisque chacune de nos cellules contient le même génome, il est possible de forcer les fibroblastes cutanés, qui ne produisent normalement pas d'érythropoïétine, à synthétiser cette hormone. Pour ce faire, il faut introduire une nouvelle région de contrôle dans le génome et ainsi lever l'interdiction de lecture (expression) du gène de l'érythropoïétine, présent mais « silencieux » dans les fibroblastes.
Dans presque tous les domaines de la médecine, soit des essais cliniques ont commencé pour le traitement de maladies héréditaires par thérapie génique, soit des approches de ce type de traitement sont développées dans le cadre d'expérimentations animales. À mesure que les méthodes de délivrance des gènes et de contrôle de leur expression s’améliorent, la liste des maladies auxquelles la thérapie génique peut être appliquée va certainement s’allonger.
L’utilisation de la thérapie génique pour le traitement du cancer ouvre d’énormes perspectives. De nombreuses années d'efforts des scientifiques ont permis de comprendre que le cancer est une maladie génétique et que son développement se déroule en plusieurs étapes, à la suite d'une série de troubles génétiques qui s'accumulent dans la cellule. Par conséquent, chacun de ces effets génétiques individuels peut devenir une cible pour une approche de thérapie génique.
2.7 Production d'animaux transgéniques
Si l'ADN est introduit dans les cellules d'un organisme multicellulaire, le résultat de la transformation sera uniquement un changement de propriétés. Petit nombre cellules qui ont acquis un ou plusieurs nouveaux gènes. Par conséquent, pour modifier les propriétés de l’organisme tout entier, il faut modifier le génome des cellules germinales, ce qui transférera les nouvelles propriétés aux descendants. Chez les plantes et les animaux, il est conseillé de modifier des propriétés telles que le taux de croissance, la résistance aux maladies et la capacité d'adaptation aux nouvelles conditions extérieures. Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (AFLP), l'analyse minisatellite, l'analyse de l'ADN microsatellite (SSR), l'hybridation, etc. peuvent être utilisés comme marqueurs dans ce cas.
Des méthodes ont été développées pour introduire des gènes dans des cellules embryonnaires de mammifères, de mouches et de certaines plantes. Après avoir travaillé avec des œufs d'amphibiens assez gros, nous sommes passés à l'étude des œufs et des embryons de souris, qui représente le mammifère le plus étudié génétiquement.
La microinjection de gènes clonés est réalisée dans l’un ou les deux pronoyaux d’un œuf de souris nouvellement fécondé. Le pronoyau mâle introduit par le spermatozoïde est le plus souvent choisi car sa taille est plus grande. Après injection, l'ovule est immédiatement implanté dans l'oviducte de la mère adoptive, ou laissé se développer en culture jusqu'au stade blastocyste, après quoi il est implanté dans l'utérus.
Vous pouvez introduire un gène dans les spermatozoïdes et ensuite procéder à une fécondation avec eux. Ainsi, des gènes d'interféron et d'insuline humains, le gène de la β-globine de lapin, le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex et l'ADNc du virus de la leucémie murine ont été injectés. Le nombre de molécules administrées par injection varie de 100 à 300 000 et leur taille varie de 5 à 50 kb. Habituellement, 10 à 30 % des œufs survivent et la proportion de souris nées d'œufs transformés varie de quelques à 40 %. L'efficacité réelle est donc d'environ 10 %.
L'intégration de gènes étrangers n'est pas spécifique aux chromosomes et le nombre de copies d'un gène étranger peut varier de quelques-uns à 100 ou plus. Ces gènes forment un groupe de répétitions en tandem, unies tête-bêche. De l'ADN étranger après injection a été trouvé dans les cellules somatiques et germinales. Cela signifie que l’intégration a lieu dès les premiers stades du développement du zygote.
Dans plusieurs cas, l’ADN hétérologue a été hérité sur trois générations de souris, indiquant une intégration stable. L'ADN intégré dans les cellules germinales est transmis sous forme de gène mendélien. Il a été établi que le niveau d'expression d'un gène étranger dépend du site d'intégration de l'ADN avec les chromosomes et du degré de sa méthylation, ainsi que de la différenciation tissulaire. Dans certains cas, il a été possible d’obtenir une expression spécifique à un tissu. Il est important de noter que des gènes étrangers spécifiques peuvent être insérés dans le génome cellulaire de telle manière qu’ils obéissent à des signaux régulateurs normaux.
En 1981, Constantini et Lacy (Oxford) ont injecté des fragments de 19 kilobases d'ADN chromosomique de lapin dans des œufs de souris. Ces fragments contenaient le gène de la β-globine de lapin. Les œufs ont été cultivés jusqu’au stade blastocyste et implantés dans l’utérus. Vingt-quatre souris nées du développement d’œufs implantés ont subi une hépatectomie partielle. L'analyse de l'ADN des cellules hépatiques a montré que chez 9 souris, il y avait de 1 à 20 copies par cellule du gène de la β-globine. Après avoir accouplé 4 mâles transformés avec des femelles normales, une progéniture de 18 animaux a été obtenue. 6 d’entre eux possédaient également le gène β-globine. Il a été établi que l’intégration des gènes dans les cellules de mammifères se produit de manière aléatoire et n’est pas associée à des régions spécifiques du chromosome. Le gène est instable et peut être perdu ou devenir inactif. Les séquences régulatrices doivent être introduites avec le gène.
La méthode d’introduction de gènes dans les cellules embryonnaires présente des limites. Il n’est pas toujours possible d’intégrer de l’ADN étranger dans une région donnée du chromosome. Les principes méthodologiques développés ne permettent pas encore de remplacer un gène existant dans le génome en le déplaçant ; il n’est pas toujours possible de subordonner le nouveau gène au système de régulation de l’organisme ;
Des problèmes inattendus peuvent survenir lors de la transgénose. Par exemple, certains des premiers travaux sur la transformation génétique des animaux ont été réalisés en insérant des gènes d’hormone de croissance. Le transfert du gène de l’hormone de croissance du rat à des souris a multiplié par 2 la croissance des souris. Des expériences sur la transgénose des gènes de l'hormone de croissance bovine chez le lapin ont également été couronnées de succès. Mais des expériences similaires sur la modification du bétail ont conduit à une augmentation de la croissance de seulement 10 à 20 %. Évidemment, cela est dû au fait que les souris conservent une norme de réaction large et que l'insertion de gènes qui augmentent la quantité d'hormone oblige le génotype à se réaliser aussi pleinement que possible. Chez l'élevage, à la suite d'une sélection dirigée, les organismes opèrent à la limite supérieure de la norme de réaction, l'effet attendu ne s'est donc pas manifesté.
Dans notre pays, des porcs porteurs du gène de la somatotropine ont été obtenus. Leurs taux de croissance ne différaient pas de ceux des animaux normaux, mais le changement de métabolisme affectait la teneur en graisse. Chez ces animaux, les processus de lipogenèse ont été inhibés et la synthèse des protéines a été activée. L’insertion de gènes de facteurs de type insuline a également entraîné des modifications du métabolisme. De tels porcs transgéniques ont été créés pour étudier la chaîne de transformations biochimiques de l'hormone, et effet secondaire il y a eu un renforcement système immunitaire.
Le système de synthèse des protéines le plus puissant se trouve dans les cellules de la glande mammaire. Si vous placez les gènes des protéines étrangères sous le contrôle du promoteur de la caséine, alors l'expression de ces gènes sera puissante et stable, et la protéine s'accumulera dans le lait (fermenteur animal). Des vaches transgéniques ont déjà été produites dont le lait contient la protéine humaine lactoferrine. Cette protéine devrait être utilisée pour la prévention des maladies gastro-entérologiques chez les personnes présentant une faible immunorésistance. Il s’agit de malades du SIDA, de bébés prématurés, de patients cancéreux ayant subi une radiothérapie. Des essais cliniques de ce lait sont en cours. Genzyme Transgenics prévoit déjà des recherches pour créer des bovins transgéniques contenant de l'albumine humaine dans leur lait. Un brevet a été acquis pour l'obtention d'embryons contenant le génome des cellules du tissu conjonctif (fibroblastes), y compris le gène responsable de la synthèse des protéines humaines. Cette technologie permet d'augmenter l'efficacité de la création d'animaux laitiers transgéniques, puisqu'avec l'injection habituelle de gènes dans un œuf fécondé, seuls 5 à 10 % des animaux transformés naissent, dont plusieurs sont des mâles qui ne produisent pas de lait.
L'utilisation de la nouvelle technologie de clonage permet d'obtenir uniquement des animaux femelles produisant des protéines transgéniques. L'albumine est utilisée en thérapie pour maintenir la pression osmotique dans le sang. Chaque année, le monde a besoin d'environ 440 000 litres de plasma sanguin pour isoler cette protéine (ce qui coûte environ 1,5 milliard de dollars). Chaque vache laitière peut produire 80 kg d’albumine humaine recombinante par an. Genzyme Transgenics développe des méthodes similaires pour produire de l'hormone de croissance humaine et de l'interféron β.
En Angleterre, des brebis transgéniques ont été créées dont le lait contient un facteur de coagulation sanguine.
Dans notre pays, il y a eu des tentatives pour créer des moutons produisant de la chymosine (une enzyme pour la fabrication du fromage). 2 moutons ont été obtenus, dans l'un le gène n'était pas exprimé, dans le second la teneur en chymosine atteignait 300 mg/l. Cependant, la progéniture de cette brebis a produit de faibles rendements laitiers - environ 50 kg pendant la période de lactation. La raison en était que la chymosine est produite comme précurseur - la prochymosine, qui est convertie en une enzyme active à pH = 5. Il était prévu de recevoir de la prochymosine, mais dans certaines zones du pis, il y avait une diminution du pH, ce qui a conduit à l'activation de la chymosine directement dans le corps. La chymosine active faisait cailler le lait et obstruait les conduits du pis. Maintenant, ils essaient de résoudre ce problème.
Dans la région de Moscou, on a obtenu des lapins sécrétant de l'interféron γ et de l'érythropoïétine, mais les lapins ne sont pas des producteurs de lait traditionnels. Les expériences de transformation des animaux de ferme sont très coûteuses : un animal transgénique coûte des dizaines, voire des centaines de milliers de dollars.
Des animaux transgéniques sont également produits à des fins de xénotransplantation. L’un des donneurs d’organes préférés est le porc, car il existe des similitudes anatomiques entre les organes et des propriétés immunologiques similaires. Les réactions de rejet lors d’une transplantation ont un mécanisme complexe. L'un des signaux permettant au corps d'attaquer un organe étranger sont les protéines localisées sur surface extérieure membranes. Chez les porcs transgéniques, ces protéines sont remplacées par des protéines humaines.
Une autre direction de la transgénose est la production d'animaux résistants aux maladies. L'élevage s'appuie sur les vaccins, car la sélection s'effectue principalement sur des caractères économiquement intéressants - laine, lait, etc. L'augmentation de la résistance est la tâche des ingénieurs généticiens. Les interférons sont des protéines protectrices, c'est pourquoi le gène de l'interféron a été inséré dans divers animaux. Les souris transgéniques ont acquis une résistance, elles ne sont pas tombées malades ou sont tombées peu malades, mais aucun effet de ce type n'a été constaté chez les porcs.
Une autre direction est l'introduction de gènes codant pour l'ARN antisens. Pour l’élevage, la leucémie provoquée par des virus à ARN constitue un problème aigu. Les lapins transgéniques porteurs des gènes responsables de la présence d'ARN antisens dans la cellule étaient résistants à la leucémie.
Les animaux transgéniques peuvent être utilisés pour étudier les maladies héréditaires du cerveau et du système nerveux. Des gènes de la maladie d'Alzheimer (le dépôt de protéine β-amyloïde conduit à la formation de plaques caractéristiques) et des gènes responsables du développement de l'épilepsie et des maladies cérébrales sont introduits dans le génome des animaux normaux ; dans ce cas, on obtient des modèles animaux transgéniques sur lesquels diverses techniques thérapeutiques peuvent être testées.
Les animaux transgéniques ont été utilisés pour étudier les maladies inflammatoires et immunologiques humaines, par ex. polyarthrite rhumatoïde. Les maladies associées au métabolisme lipidique sont modélisées.
Conclusion
Même si la génétique et le génie génétique jouent déjà un rôle important en médecine et agriculture, les principaux résultats restent à venir. Nous avons encore beaucoup à apprendre sur le fonctionnement des systèmes génétiques complexes de notre corps et d’autres espèces.
Il est nécessaire de déterminer les fonctions et la finalité de chaque gène, de déterminer quelles sont les conditions de son activation, à quelles périodes de la vie, dans quelles parties du corps et dans quelles circonstances il s'active et conduit à la synthèse de la protéine correspondante. . Ensuite, il est nécessaire de comprendre quel rôle cette protéine joue dans le corps, si elle va au-delà de la cellule, quels messages elle véhicule, quelles réactions elle catalyse, comment elle affecte le lancement de processus biologiques dans d'autres parties du corps, et quoi. gènes qu’il active. Une autre tâche difficile consiste à résoudre le problème du repliement des protéines - comment, connaissant la séquence d'acides aminés qui composent une protéine, déterminer sa structure spatiale et ses fonctions. Ce problème nécessite de nouvelles connaissances théoriques et des supercalculateurs plus puissants.
Mais les scientifiques ne sont pas intimidés par l’ampleur de cette tâche. Le décodage du génome humain a pris plus de dix ans, résoudre le problème du repliement des protéines peut prendre un peu plus de temps, mais lorsqu'il sera résolu, une personne sera capable de contrôler complètement les processus vitaux de n'importe quel organisme à tous les niveaux.
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La technique, développée par des scientifiques de l'Université de Californie à Irvine sous la direction du Dr Peter Donovan et basée sur une combinaison de deux méthodes connues de manipulation des cellules souches embryonnaires, double l'efficacité de la transmission de l'ADN aux cellules souches embryonnaires humaines.
Les méthodes modernes d’introduction de l’ADN dans les CSEh par transfection chimique, nucléofection et électroporation présentent un sérieux inconvénient : une faible efficacité. Livraison de matériel génétique aux CSEh en utilisant infection virale plus efficace, mais a de nombreuses conséquences indésirables pour les cellules souches et ne peut pas être qualifié de totalement sûr d'un point de vue médical si les cellules sont destinées à une transplantation ultérieure.
La nouvelle technique, basée sur une combinaison de nucléofection d'une seule cellule souche et d'une méthode optimisée de sélection des colonies transgéniques résultantes, garantit une expression rapide et stable des transgènes dans les cellules. La nucléofection implique la formation de pores dans la membrane cellulaire à l'aide d'impulsions électriques et l'introduction ultérieure d'ADN dans la cellule.
En plus du gène d'intérêt, la construction d'ADN modificatrice porte un gène qui permet un suivi facile de la cellule transformée, par exemple le gène codant pour la protéine fluorescente verte humanisée Renilla (hrGFP). Cette méthode de marquage cellulaire permet d'observer le mouvement des cellules transformées lors de leur transplantation chez l'animal.
Potentiellement, cette méthode pourrait être utile pour le traitement de maladies monogéniques provoquées par des mutations d’un gène dans toutes les cellules d’une personne malade. Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus de 10 000 maladies humaines sont de nature monogénique. Des millions de personnes dans le monde souffrent de maladies monogéniques, notamment la maladie de Huntington, la drépanocytose, l'hémophilie et la mucoviscidose.
La nouvelle méthode élargira les possibilités de manipulation des cellules hES, permettant ainsi de modéliser des maladies humaines et de trouver des médicaments adaptés. Grâce à cette technique, les scientifiques pourront corriger les troubles génétiques des cellules souches et utiliser des cellules saines en médecine régénérative.
Colonie de cellules hES exprimant les protéines fluorescentes vertes hrGFP.
Article de Hohenstein KA et al. « La nucléofection médie l'inactivation génique stable à haute efficacité et l'expression transgénique dans les cellules souches embryonnaires humaines » est disponible dans la version en ligne de la revue. Cellules souches depuis le 6 mars 2008.
Comme le montrent de nombreuses études, l’utilisation de divers virus est très solution efficace, qui permet de passer à travers les défenses immunitaires de l'organisme, puis infecter les cellules et les utiliser pour propager le virus. Pour réaliser cette procédure, les ingénieurs généticiens ont sélectionné les virus les plus adaptés dans le groupe des rétrovirus et des adénovirus. Les rétrovirus introduisent des informations génétiques sous forme d’acide ribonucléique (ARN), une molécule similaire à l’ADN qui aide à traiter les informations génétiques stockées dans l’ADN. Dès qu'il est possible de pénétrer profondément dans la cellule dite cible, une copie de la molécule d'ADN est obtenue à partir de la molécule d'ARN. Ce processus est appelé transcription inverse. Une fois qu’une nouvelle molécule d’ADN est attachée à une cellule, toutes les nouvelles copies des cellules contiendront ce gène modifié.
Les adénovirus transportent l'information génétique directement sous forme d'ADN, qui est transmise à une cellule qui ne se divise pas. Bien que ces virus délivrent de l'ADN directement dans le noyau de la cellule cible, l’ADN ne correspond pas au génome de la cellule. Ainsi, le gène modifié et les informations génétiques ne sont pas transmis aux cellules filles. L'avantage de la thérapie génique réalisée à l'aide d'adénovirus est qu'elle permet d'introduire des gènes dans les cellules du système nerveux et dans la muqueuse des voies respiratoires, toujours par l'intermédiaire d'un vecteur. En outre, il existe une troisième méthode de thérapie génique, réalisée par l'intermédiaire des virus dits adéno-associés. Ces virus contiennent quantité relativement faible d'informations génétiques, et sont beaucoup plus difficiles à éliminer que les rétrovirus et les adénovirus. Cependant, l’avantage des virus adéno-associés est qu’ils ne provoquent pas de réaction du système immunitaire humain.
Méthode généalogique de l'anthropogénétique
Cette méthode est basée sur la compilation et l'analyse de pedigrees. Cette méthode a été largement utilisée depuis l'Antiquité jusqu'à nos jours dans l'élevage de chevaux, la sélection de lignées précieuses de bovins et de porcs, pour l'obtention de chiens de race pure, ainsi que pour l'élevage de nouvelles races d'animaux à fourrure.
En tant que méthode d'étude de la génétique humaine, la méthode généalogique n'a commencé à être utilisée qu'à partir du début du 20e siècle, lorsqu'il est devenu clair que l'analyse des pedigrees, qui retracent la transmission de génération en génération d'un certain trait (maladie), peut remplacer la méthode hybridologique, actuellement inapplicable à l’homme.
Lors de la compilation des pedigrees, le point de départ est la personne - le proposant dont le pedigree est étudié. Il s'agit généralement soit d'un patient, soit d'un porteur d'un certain trait dont l'héritage doit être étudié. Lors de l'établissement des tableaux généalogiques, les symboles proposés par G. Just en 1931 sont utilisés (Fig. 6.24). Les générations sont désignées par des chiffres romains, les individus d'une génération donnée sont désignés par des chiffres arabes.
Grâce à la méthode généalogique, le caractère héréditaire du trait étudié peut être établi, ainsi que le type de son héritage (autosomique dominant, autosomique récessif, dominant lié à l'X ou récessif, lié à l'Y). Lors de l'analyse des pedigrees pour plusieurs caractéristiques, la nature liée de leur héritage peut être révélée, qui est utilisée dans la compilation de cartes chromosomiques. Cette méthode permet d'étudier l'intensité du processus de mutation, d'évaluer l'expressivité et la pénétrance de l'allèle. Il est largement utilisé dans le conseil génétique médical pour prédire la progéniture. Il convient toutefois de noter que l’analyse généalogique devient nettement plus compliquée lorsque les familles ont peu d’enfants.
