अमीनो एसिड का पता लगाने के लिए अभिकर्मक का उपयोग किया जाता है। पेपर क्रोमैटोग्राफी द्वारा अमीनो एसिड का मात्रात्मक निर्धारण। अमीनो एसिड निर्धारित करने की विधियाँ

यह लेख अमीनो एसिड निर्धारित करने के तरीकों पर चर्चा करेगा, जिनका उपयोग न केवल उत्पादों के विश्लेषण में, बल्कि जैव रसायन और फार्मास्युटिकल विश्लेषण में भी किया जाता है।

अमीनो एसिड की कुल मात्रा केजेल्डहल विधि का उपयोग करके अमीनो एसिड से प्राप्त अमोनिया के निर्धारण के आधार पर एक फोटोमेट्रिक विधि द्वारा निर्धारित की जा सकती है।

1-नैफ्थॉल के साथ प्रतिक्रिया। आर्जिनिन, हिस्टिडाइन और टायरोसिन को निर्धारित करने के लिए, 1-नेफ़थॉल के साथ एक प्रतिक्रिया प्रस्तावित की गई थी। सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaOCl) की उपस्थिति में, घोल लाल हो जाता है। 50% इथेनॉल में अमीनो एसिड युक्त एक नमूना समाधान को बर्फ से ठंडा किया जाता है और 10% NaOCl समाधान और एक नेफ़थॉल समाधान मिलाया जाता है। प्रतिक्रिया उत्पाद लाल रंग का है (एल अधिकतम = 550 एनएम)। अमीनो एसिड की सामग्री परिणामी समाधान की रंग तीव्रता से निर्धारित होती है।

ब्यूरेट प्रतिक्रिया. अमीनो एसिड निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे महत्वपूर्ण प्रतिक्रियाओं में से एक बायोरेट प्रतिक्रिया है। प्रतिक्रिया एक क्षारीय घोल में पतला ब्यूरेट मिलाकर की जाती है जलीय घोलतांबा (द्वितीय) लवण। इस मामले में, एक जटिल यौगिक के निर्माण के कारण घोल गहरे बैंगनी रंग में बदल जाता है।

ब्यूरेट प्रतिक्रिया में कम से कम 2 एमाइड समूह या एक एमिनोहाइड्रॉक्सीएथिलीन समूह वाले यौगिक शामिल होते हैं, साथ ही एमिनो एसिड के एमाइड और इमाइड भी शामिल होते हैं। यह प्रतिक्रिया प्रोटीन और अमीनो एसिड और एमाइड्स के केंद्रित समाधानों द्वारा की जाती है। अमीनो एसिड के पतला घोल ब्यूरेट प्रतिक्रिया नहीं देते हैं और इसलिए प्रतिक्रिया का उपयोग प्रोटीन हाइड्रोलिसिस के अंत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। प्रतिक्रिया का उपयोग प्रोटीन के गुणात्मक और मात्रात्मक निर्धारण के लिए भी किया जाता है। बायोरेट प्रतिक्रिया रक्त और अन्य जैविक तरल पदार्थों में प्रोटीन का निर्धारण करने के लिए नैदानिक ​​​​नैदानिक ​​​​प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली विधियों का आधार है।

निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया. अमीनो एसिड निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली दूसरी सबसे महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया है - ए-अमीनो एसिड के लिए एक रंग प्रतिक्रिया, जो बाद वाले को गर्म करके की जाती है। क्षारीय घोलअतिरिक्त निनहाइड्रिन.

निनहाइड्रिन अमोनिया के निर्माण के साथ ए-अमीनो एसिड का ऑक्सीडेटिव डीकार्बाक्सिलेशन करता है, कार्बन डाईऑक्साइडऔर एक एल्डिहाइड जिसमें मूल अमीनो एसिड की तुलना में एक कम कार्बन परमाणु होता है। कम किया गया निनहाइड्रिन आगे जारी अमोनिया और दूसरे निनहाइड्रिन अणु के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिससे अमोनिया के साथ एक रंगीन संघनन उत्पाद बनता है।

परिणामी यौगिक (वर्णक) का रंग बैंगनी-नीला (एल अधिकतम = 570 एनएम) है। इस रंगीन यौगिक के निर्माण का उपयोग मात्रात्मक ए-एमिनो एसिड परीक्षण में किया जाता है, जो 1 माइक्रोग्राम जितनी छोटी मात्रा में भी अमीनो एसिड का पता लगा सकता है।

प्रोलाइन और हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन, जिनमें ए-एमिनो समूह नहीं है, निनहाइड्रिन के साथ प्रतिक्रिया करके डेरिवेटिव बनाते हैं पीला रंग(एल अधिकतम = 440 एनएम)। प्रतिक्रिया विशिष्ट नहीं है, क्योंकि अमोनिया और अमीनो समूह (अमाइन, प्रोटीन, पेप्टाइड्स) वाले यौगिक भी निनहाइड्रिन के साथ एक रंगीन उत्पाद बनाते हैं। हालाँकि, इन यौगिकों के साथ कोई CO2 जारी नहीं होता है। कार्बन डाइऑक्साइड का निकलना केवल ए-अमीनो एसिड की विशेषता है। प्रतिक्रिया का उपयोग ए-अमीनो एसिड के वर्णमिति मात्रात्मक निर्धारण के लिए किया जाता है, जिसमें स्वचालित अमीनो एसिड विश्लेषक (सीओ 2 मात्रा का माप) शामिल है।

निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया का उपयोग ग्लाइसिन, आइसोल्यूसीन और ल्यूसीन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है; सेरीन, फेनिलएलनिन, सिस्टीन, टायरोसिन, ट्रिप्टोफैन, आदि कम तीव्र रंग देते हैं।

परिणामी उत्पादों का रंग काफी गहरा होता है (e = 1.8–3.3·10 4), लेकिन रंगीन उत्पाद अस्थिर होते हैं। रंग की तीव्रता तेजी से कम हो जाती है। स्थिरीकरण के लिए CdCl 2 जोड़ा गया है। यह परिणामी यौगिकों के साथ स्थिर संकुल बनाता है। कैडमियम क्लोराइड भी प्रतिक्रिया को तेज करता है।

अमीनो एसिड और अमीनो समूह वाले कुछ अन्य यौगिक संघनित होते हैं क्षारीय वातावरण 1,2-नेफ्थोक्विनोन - 4-सल्फोक्सिलॉट के साथ 1,2-नेफ्थोक्विनोन मोनोइमाइन के लाल, पीले, नारंगी डेरिवेटिव बनाते हैं।

प्रतिक्रिया का उपयोग ए-एमिनोक्सिलेट्स (वेलिन, आइसोल्यूसीन, ल्यूसीन, आदि) निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

ट्रिप्टोफैन निर्धारित करने के लिए, 4-डाइमिथाइलैमिनोबेंज़ाल्डिहाइड के साथ प्रतिक्रिया का उपयोग किया जा सकता है। प्रतिक्रिया उत्पाद बैंगनी है और विश्लेषण किए गए समाधान में ट्रिप्टोफैन सामग्री रंग की तीव्रता से निर्धारित होती है।

हालाँकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रतिक्रिया का उपयोग खाद्य विश्लेषण में शायद ही कभी किया जाता है।

सल्फर युक्त अमीनो एसिड के मात्रात्मक निर्धारण के लिए, निम्नलिखित प्रतिक्रिया के आधार पर ब्रोमैटोमेट्रिक विधि का उपयोग किया जाता है:

1% NaOH घोल में सिस्टीन का घोल ग्राउंड स्टॉपर के साथ फ्लास्क में डाला जाता है, 0.1 N मिलाया जाता है। पोटेशियम ब्रोमेट घोल, सूखा पोटेशियम ब्रोमाइड और 10% एचसीएल के साथ अम्लीकृत।

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप बनने वाला ब्रोमीन, जिसकी मात्रा पोटेशियम ब्रोमेट की मात्रा के बराबर होती है, अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया करता है। 10 मिनट के बाद, पोटेशियम आयोडाइड मिलाया जाता है, जो अप्रयुक्त ब्रोमीन के साथ प्रतिक्रिया करता है, और जारी आयोडीन को 0.1 एन के साथ अनुमापनित किया जाता है। एक संकेतक के रूप में स्टार्च के साथ सोडियम थायोसल्फेट घोल।

2आई - + बीआर 2 → बीआर - + आई 2

अनुमापन के लिए उपयोग की जाने वाली थायोसल्फेट की मात्रा ब्रोमीन की मात्रा के बराबर है जो अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया नहीं करती है। अतिरिक्त पोटेशियम ब्रोमेट और थायोसल्फेट की मात्रा के बीच अंतर के आधार पर, अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया में गए ब्रोमीन की मात्रा और इसलिए अमीनो एसिड की मात्रा पाई जाती है।

मेथियोनीन इसी प्रकार निर्धारित होता है। मेथिओनिन को सल्फोन में ऑक्सीकृत किया जाता है:

यह प्रतिक्रिया जब कुछ शर्तेंआपको मेथिओनिन सामग्री को बहुत सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देता है।

अमीनो एसिड निर्धारित करने की विधियाँ

अमीनो एसिड जैविक रूप से होते हैं सक्रिय पदार्थ, वे मानव शरीर के जीवन में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं, उनका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है दवाइयाँ. उनमें से कुछ आवश्यक हैं और भोजन के साथ शरीर में प्रवेश करते हैं। वर्तमान में, औषधीय पौधों की सामग्री में अमीनो एसिड के मात्रात्मक निर्धारण के लिए कई विधियाँ हैं, जिनमें शामिल हैं दवाइयाँऔर खाद्य उत्पादों में जैविक तरल पदार्थ।

विभिन्न वस्तुओं में अमीनो एसिड के मात्रात्मक निर्धारण के लिए विभिन्न तरीकों में से, चार मुख्य समूहों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है: विश्लेषण के क्रोमैटोग्राफिक, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक, टाइट्रिमेट्रिक और इलेक्ट्रोकेमिकल तरीके।

क्रोमैटोग्राफ़िक विधियाँ

पिछले दशकों में, अमीनो एसिड की गैस-तरल क्रोमैटोग्राफी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। माइक्रोपैक्ड कॉलम का उपयोग करने वाली एक विधि प्रस्तावित की गई है, जो अपेक्षाकृत अनुमति देती है छोटी अवधिजैविक रूप से महत्वपूर्ण 17 α-अमीनो एसिड को लगभग पूरी तरह से अलग करें।

सीरम, प्लाज्मा, मूत्र और के नमूनों में गैस-तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके अमीनो एसिड के निर्धारण के लिए एक विधि विकसित की गई है। मस्तिष्कमेरु द्रव, 2,3,4,5,6-पेंटाफ्लोरोबेंज़ॉयल-आइसोब्यूटाइल ईथर की तैयारी के आधार पर, एक लौ आयनीकरण डिटेक्टर के साथ 140 डिग्री सेल्सियस से 250 डिग्री सेल्सियस तक तापमान प्रोग्रामिंग मोड में पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन कॉलम पर पृथक्करण के बाद। क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण का समय 28 मिनट है। शोध के परिणामस्वरूप, 27 अमीनो एसिड अलग हो गए।

अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विधियों की विविधता के बावजूद, सबसे तेज़ और सुलभ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक पहचान के साथ रिवर्स-चरण संस्करण है। सफल पृथक्करण और पता लगाने के लिए, अमीनो एसिड को हाइड्रोफोबिक और प्रकाश-अवशोषित डेरिवेटिव में परिवर्तित किया जाता है, अर्थात, पूर्व-स्तंभ व्युत्पन्न किया जाता है। ऑर्थोफ्थेलिक एल्डिहाइड, नेफ़थलीन-2,3-डाइकारबॉक्साइलडिहाइड, और 9-फ्लोरेनिलमिथाइलक्लोरोफॉर्मेट का उपयोग व्युत्पन्न अभिकर्मकों के रूप में किया जाता है।

दवा "एल्टासिन" में एल-सिस्टीन, एल-ग्लूटामिक एसिड और ग्लाइसीन के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक विधि विकसित की गई है, जिसमें एंटीजाइनल प्रभाव के साथ संयोजन में एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि होती है। ग्लूटामिक एसिड और ग्लाइसिन को अभिकर्मक ऑर्थोफथालिकडिहाइड/एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन के साथ पूर्व-स्तंभ व्युत्पन्न के बाद रिवर्स-चरण उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा निर्धारित किया गया था। लेखकों के अनुसार, सिस्टीन का व्युत्पन्नीकरण, अमीनो एसिड और परिणामी डेरिवेटिव की अस्थिरता के कारण मुश्किल है। इसलिए, ब्रोमेटोमेट्रिक अनुमापन द्वारा सिस्टीन विश्लेषण किया गया। यह पाया गया कि नमूने में महत्वपूर्ण मात्रा में सिस्टीन की उपस्थिति ऑर्थोफथेलिक एल्डिहाइड/एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन अभिकर्मक के साथ ग्लाइसीन और ग्लूटामिक एसिड के व्युत्पन्न उत्पादों के निर्धारण में हस्तक्षेप नहीं करती है। विधि को उच्च प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता और निर्धारण की सटीकता की विशेषता है।

उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अमीनो एसिड के पृथक्करण और मात्रात्मक विश्लेषण के उद्देश्य से इसके डेरिवेटिव के पूर्व-स्तंभ गठन के लिए फ्लोरोजेनिक लेबलिंग अभिकर्मक के रूप में 4,7-फेनेंथ्रोलाइन-5,6-डायोन (फैनक्विनोन) का उपयोग करने की संभावना थी। की जाँच की। कोई आंतरिक प्रतिदीप्ति नहीं होने के कारण, फैनक्विनोन अमीनो एसिड के अमीनो समूहों (160 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर) के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिससे इमिनोक्विनोल बनता है, जिसकी प्रतिदीप्ति 460 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर मापी जाती है। पृथक डेरिवेटिव की पहचान टीएम, आईआर, द्रव्यमान और पीएमआर स्पेक्ट्रा द्वारा की गई थी। उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी एक क्रोमैटोग्राफ पर एक फ्लोरोसेंट डिटेक्टर और मिश्रण के साथ ग्रेडिएंट रेफरेंस वाले एक कॉलम पर की गई थी: ट्राइथाइलमाइन समाधान - फॉस्फेट बफर (पीएच 3) - मेथनॉल। क्विनिडाइन का उपयोग आंतरिक मानक के रूप में किया गया था। यह विधिबड़ी प्रयोगशालाओं में काफी आशाजनक है और इसे तैयार खुराक रूपों में अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए प्रस्तावित किया जा सकता है।

लाइसिन के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक पोटेंशियोमेट्रिक बायोसेंसर के साथ एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी तकनीक विकसित की गई है। बायोसेंसर का निर्माण आयन-चयनात्मक NH4+ इलेक्ट्रोड में लाइसिन ऑक्सीडेज युक्त झिल्ली को जोड़कर किया जाता है। लाइसिन के एंजाइमैटिक क्षरण के दौरान उत्पन्न अमोनियम आयनों का पोटेंशियोमेट्रिक रूप से पता लगाया जाता है। कल्चर तरल पदार्थों में ट्रिप्टोफैन के विश्लेषण के लिए एक क्रोमैटोडेंसिटोमेट्रिक एक्सप्रेस विधि विकसित की गई है। सॉर्बफिल प्लेटों पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी की गई। 25 मिनट के लिए सिस्टम प्रोपेनॉल-2 - 25% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड घोल (7:3) में क्रोमैटोग्राफी की गई। क्रोमैटोग्राम को कमरे के तापमान पर सुखाया गया और 15 मिनट के लिए 120°C पर रखा गया। क्रोमैटोग्राम पर धब्बे का पता लगाने के लिए, एक विशिष्ट अभिकर्मक का उपयोग किया गया था - 4-डाइमिथाइलैमिनोबेंज़ाल्डिहाइड, ट्रिप्टोफैन के इंडोल रिंग के लिए चयनात्मक, 5% केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड के साथ 0.5% इथेनॉल समाधान के रूप में। 4-डाइमिथाइलैमिनोबेंज़ाल्डिहाइड के ताजे तैयार घोल के साथ टेफ्लॉन क्युवेट में डुबो कर क्रोमैटोग्राम विकसित करने के बाद, उन्हें 110 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 5-7 मिनट तक रखा गया। कंप्यूटर वीडियो डेंसिटोमीटर पर 625 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर ट्रिप्टोफैन स्पॉट की स्कैनिंग की गई। विकसित विधि, बावजूद उच्च सटीकताट्रिप्टोफैन के लिए विशिष्ट परिभाषाएँ और प्रदर्शन।

जैविक तरल पदार्थों, दवाओं और खाद्य उत्पादों में β-अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए, घटकों के पृथक्करण पर आधारित केशिका वैद्युतकणसंचलन विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। जटिल मिश्रणलागू की कार्रवाई के तहत एक क्वार्ट्ज केशिका में विद्युत क्षेत्र. चूंकि अमीनो एसिड प्रकृति में ज़्विटरियोनिक होते हैं, इसलिए उन्हें उचित पीएच मान के साथ इलेक्ट्रोलाइट बफर समाधान का उपयोग करके अलग किया जा सकता है, अक्सर तटस्थ और बुनियादी पृथक्करण बफर का उपयोग किया जाता है।

व्यक्तिगत β-अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए केशिका वैद्युतकणसंचलन विधि की विशिष्टता और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, उनके प्रारंभिक व्युत्पन्न का उपयोग किया जाता है, इसके बाद क्वार्ट्ज केशिका में पृथक्करण और प्रतिक्रिया उत्पादों का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक निर्धारण किया जाता है। इस प्रकार, 9-फ्लोरेनिल मिथाइल फॉर्मेट, 9-(2-कार्बाज़ोल)-एथिल क्लोरोफॉर्मेट, और साइनाइन डाई का उपयोग व्युत्पन्न एजेंटों के रूप में किया जाता है। विधि की संभावनाएं तेजी से विश्लेषण, नमूना तैयार करने में आसानी, अभिकर्मकों की कम खपत और उपकरण की सादगी जैसे फायदों के कारण हैं।

और प्रोटीन

यह ज्ञात है कि कैनोनिकल α-अमीनो एसिड की सभी 20 किस्मों की संरचना समान होती है, जिसमें कार्यात्मक समूहों के तीन प्रकार होते हैं (चित्र 3.3)। दुर्भाग्य से, अमीनो और कार्बोक्सी समूहों पर प्रतिक्रियाएँ बहुत विशिष्ट नहीं हैं, क्योंकि तदनुसार, वे सभी एमाइन, कई एमाइड और कार्बोक्जिलिक एसिड की विशेषता हैं। यही बात उनके अधिकांश रेडिकल = आर पर लागू होती है, जिनमें से 10 गैर-ध्रुवीय हैं, यानी, एलिफैटिक = हाइड्रोकार्बन समूहों द्वारा दर्शाए जाते हैं, जिनमें से अधिकांश रासायनिक रूप से निष्क्रिय हैं। अधिकांश आर ध्रुवीय अमीनो एसिड की विशिष्टता, जिनमें अल्कोहल (सेर, ट्रे, टीयर), एमाइड (एएसएन, ग्लन) और कार्बोक्सी समूह (एएसपी, ग्लू) शामिल हैं, भी अपेक्षाकृत कम है। अमीनो समूह (Lys), इमिडाज़ोल His और गुआनिडीनो समूह Arg अधिक सक्रिय हैं, और थियो समूह Cys की गतिविधि अधिकतम है। इसलिए सबसे महान व्यवहारिक महत्वअमीनो एसिड विश्लेषक सहित α-अमीनो एसिड के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण में, एक सार्वभौमिक निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया प्राप्त की गई थी, जो α-C परमाणु पर अमीनो और कार्बोक्सी दोनों समूहों की एक साथ उपस्थिति के लिए विशिष्ट थी।

चावल। 3.3. सामान्य सूत्रα-अमीनो एसिड की संरचनाएं और उनके पोलीमराइज़ेशन उत्पाद। पाठ में स्पष्टीकरण.

पेप्टाइड्स और प्रोटीन की संरचना में α-अमीनो एसिड का पॉलिमराइजेशन (चित्र 3.3) उनके सभी आर प्रकारों को बरकरार रखता है, लेकिन:

1. निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया नकारात्मक हो जाती है, क्योंकि एन- और सी-टर्मिनल के अपवाद के साथ, α-एमिनो और α-कार्बोक्सी समूह पेप्टाइड बॉन्ड के निर्माण पर खर्च किए जाते हैं। प्रोटीन के साथ एक सकारात्मक निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया सबसे अधिक संभावना तैयारी या कंटेनर में अमीनो एसिड अशुद्धियों की उपस्थिति को इंगित करती है।

2. सभी पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए, एक ब्यूरेट प्रतिक्रिया एक पेप्टाइड समूह के लिए विशिष्ट होती है जो मोनोमेरिक अमीनो एसिड में अनुपस्थित होती है।

3. आर अमीनो एसिड के लिए अधिक विशिष्ट प्रतिक्रियाओं में से, निम्नलिखित उपयोगी हैं: सुगंधित आर फेन, टीयर, ट्राई के लिए केंद्रित नाइट्रिक एसिड के साथ ज़ैंथोप्रोटीन प्रतिक्रिया; पांच-सदस्यीय प्रो रिंग पर आईसैटिन के साथ प्रतिक्रिया, साथ ही इमिडाज़ोल आर हिस, थियो समूह सीआईएस और गुआनिडिनो समूह आर्ग पर प्रतिक्रियाएं। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि इनमें से कुछ आर प्रोटीन ग्लोब्यूल्स के अंदर छिपे हुए हैं और इसलिए गुणात्मक प्रतिक्रियाएँउन पर कमजोर पड़ गए हैं. इसलिए, उन्हें क्रियान्वित करने से पहले, प्रोटीन आमतौर पर किसी न किसी तरह से विकृत हो जाते हैं।

4. अमीनो एसिड के वास्तविक समाधानों के विपरीत, प्रोटीन के कोलाइडल समाधान की विशेषता होती है तलछटी प्रतिक्रियाएँ, उनके जलयोजन शैलों के विनाश से जुड़ा हुआ है और परिणामस्वरूप, पानी हटाने वाले एजेंटों के प्रभाव में उनकी घुलनशीलता में कमी आई है: तटस्थ लवण = नमकीन बनाना, मेथनॉल = MeOH, इथेनॉल = EtOH, एसीटोन, यूरिया और अन्य एजेंट।

गुणात्मक प्रतिक्रियाएँ करते समय, आपको यह करना चाहिए:

1. नियमों का ध्यानपूर्वक पालन करें आग सुरक्षाऔर सांद्र अम्ल और क्षार के साथ कार्य करें = EZh.

2. कांच के ग्राफ या फेल्ट-टिप पेन से टेस्ट ट्यूब की 2 पंक्तियों को चिह्नित करें और उनमें से एक में 1% अमीनो एसिड समाधान के 0.5 मिलीलीटर (2-5 बूंद) से अधिक न रखें, और 1 की लगभग समान मात्रा रखें। दूसरे में % प्रोटीन घोल.

3. अमीनो एसिड और प्रोटीन समाधान के साथ परीक्षण ट्यूबों की एक जोड़ी में, समानांतर में संबंधित अभिकर्मकों की 3-5 बूंदें जोड़ें और संबंधित प्रतिक्रिया के लिए संकेतित शेष प्रक्रियाओं को पूरा करें।

4. यदि परखनलियों को गर्म करना आवश्यक हो तो क्रूसिबल का ढक्कन हटा दें और सूखे ईंधन को माचिस से जलाएं। फिर, टेस्ट ट्यूब को एक होल्डर में जकड़ें, जिसका प्रारंभिक डिज़ाइन बहुत अविश्वसनीय है। इसलिए, कुछ परखनलियों को पट्टियों में मोड़कर कागज के एक टुकड़े में लपेटना और उन्हें पकड़कर रखना बेहतर है अँगूठा, समान रूप से पास करें निचला भागलौ के माध्यम से टेस्ट ट्यूब, पड़ोसियों पर गर्दन उठाने से बचें और समाधान को हिंसक रूप से उबलने दें. ऑपरेशन पूरा करने के बाद, क्रूसिबल ढक्कन से लौ को तुरंत बुझा दें।

5. प्रयोगों के परिणाम, टेम्पलेट के अनुसार तैयार किए जाते हैं प्रयोगशाला नोटबुक के प्रसार परतालिका रूप में:

6. प्राप्त परिणामों पर विचार करने और प्रोटोकॉल पूरा करने के बाद, टेस्ट ट्यूब की एक रैक के साथ, उन्हें सुरक्षा के लिए शिक्षक के सामने प्रस्तुत करें।

1. निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया।निनहाइड्रिन के अल्कोहल समाधान के साथ α-एमिनो एसिड के डीमिनेशन और डीकार्बाक्सिलेशन के आधार पर:

परिणामी अमोनिया, निनहाइड्रिन के दो अणुओं के साथ प्रतिक्रिया करके, 540 एनएम (प्रो - 440 एनएम) पर अधिकतम अवशोषण के साथ एक रंगीन व्युत्पन्न बनाता है।

प्रगति: परीक्षण नमूनों में 0.5% की 3-5 बूंदें जोड़ें शराब समाधाननिनहाइड्रिन। मिश्रण के साथ परखनलियों को आंच पर धीरे से गर्म करें और 2-3 मिनट के बाद, रंग की उपस्थिति को रिकॉर्ड करें।

2. ज़ैंथोप्रोटीन प्रतिक्रिया।जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, यह सुगंधित आर: फेन, टीयर, ट्राई के साथ अमीनो एसिड के नाइट्रो डेरिवेटिव के गठन पर आधारित है।

प्रगति: धूआं हुड के ड्राफ्ट को चालू करते हुए, परीक्षण समाधान के साथ टेस्ट ट्यूब की एक जोड़ी में ध्यान से केंद्रित नाइट्रिक एसिड (एचएनओ 3) की कुछ बूंदें जोड़ें। टेस्ट ट्यूबों को आंच पर धीरे से गर्म करें, गर्दन को पड़ोसियों की ओर करने से बचें, और रंग के विकास को रिकॉर्ड करें।

3. नाइट्रोप्रासाइड प्रतिक्रिया।यह सोडियम सल्फाइड (Na 2 S) की रिहाई के साथ सल्फर युक्त अमीनो एसिड सिस्टीन के क्षारीय हाइड्रोलिसिस पर आधारित है, जो सोडियम नाइट्रोप्रासाइड के ताजा तैयार समाधान के साथ एक लाल कॉम्प्लेक्स देता है।

प्रगति:दोनों परखनलियों में परीक्षण समाधान की 5-10 बूंदें डालें समान मात्रा 20 % कटू सोडियमऔर कम से कम 3-5 मिनट तक उबालें। परखनलियों में सोडियम नाइट्रोप्रासाइड घोल की 3-5 बूंदें डालें और रंग के विकास को रिकॉर्ड करें।

4. ब्यूरेट प्रतिक्रिया.यह एक क्षारीय वातावरण में Cu 2+ आयन के साथ पेप्टाइड बंधन के रंगीन परिसर के गठन पर आधारित है। समाधानों में पेप्टाइड्स और प्रोटीन की पहचान के लिए एक सार्वभौमिक परीक्षण के रूप में कार्य करता है। चूंकि पेप्टाइड बांड की बढ़ती संख्या के साथ, समाधान की रंग तीव्रता रैखिक रूप से बढ़ जाती है, इसका उपयोग प्रोटीन सांद्रता के फोटोमेट्रिक निर्धारण के लिए व्यापक रूप से किया जाता है।

प्रगति. परीक्षण समाधान की 5-10 बूंदों के साथ परीक्षण ट्यूबों में 10% सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान की समान मात्रा जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं और 1% कॉपर सल्फेट घोल (CuSO4) की 2 बूंदें डालें। नमूनों को मिलाएं और कुछ मिनटों के बाद रंग विकास को रिकॉर्ड करें।

5. उबलने का परीक्षण.प्रोटीन के तापीय विकृतीकरण पर आधारित।

प्रगति. 1% एसिटिक एसिड सॉल्यूशन (एसीओएच) की एक बूंद से अधिक न डालें और उबलने तक गर्म करके दोनों टेस्ट ट्यूबों को टेस्ट सॉल्यूशन से अम्लीकृत करें। घोल को 2-3 मिनट तक उबालने के बाद, परिणाम रिकॉर्ड करें और घटना के तंत्र की व्याख्या करें।

6. भारी धातु लवणों का अवक्षेपण(मेह) . उनके विकृतीकरण गुण प्रोटीन अणु के आर कार्यात्मक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए भारी मी धनायनों की क्षमता पर आधारित होते हैं: थियो-, अमीनो-, कार्बोक्सी-, एरोमैटिक। इसके अलावा, उनके मजबूत आयन प्रोटीन अणुओं में आयनिक समूहों के रिचार्जिंग का कारण बनते हैं, जिससे उनमें आयनिक बंधन नष्ट हो जाते हैं।

प्रगति. परीक्षण समाधान के साथ दोनों परखनलियों में 5% कॉपर सल्फेट घोल (CuSO 4) की कुछ बूंदें डालें। प्राप्त परिणामों को रिकॉर्ड करें और समझाएं।

7. कार्बनिक अम्लों द्वारा अवक्षेपण।प्रोटीन के एसिड विकृतीकरण और ऑर्गेनोक्लोरिन के साथ आर अमीनो एसिड के थायो-, अमीनो- और सुगंधित समूहों के सहसंयोजक डेरिवेटिव के गठन पर आधारित है।

प्रगति. परीक्षण समाधान के साथ परीक्षण ट्यूबों में ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) के 10% समाधान की कुछ बूंदें जोड़ें और, कुछ मिनटों के बाद, परिणाम रिकॉर्ड करें

उपकरण और अभिकर्मक: क्रोमैटोग्राफी पेपर; क्रोमैटोग्राफी कक्ष; फोटोइलेक्ट्रिक कलरमीटर; कैंची; कांच की प्लेटें (3´32 सेमी) - 3 पीसी ।; क्रोमैटोग्राम के लिए धारक; सुखाने की कैबिनेट; माइक्रोपिपेट; ग्राउंड स्टॉपर्स के साथ टेस्ट ट्यूब; ब्यूरेट 25 मिली; अमीनो एसिड का मानक मिश्रण; अमीनो एसिड का परीक्षण मिश्रण; ब्यूटेनॉल, एसिटिक एसिड, पानी 15:3:7 के अनुपात में; 95% एसीटोन में निनहाइड्रिन का 1% घोल; एथिल अल्कोहल (75%), कॉपर सल्फेट से संतृप्त।

काम पूरा करना

18 x 28 सेमी मापने वाले क्रोमैटोग्राफ़िक पेपर की एक शीट लें और इसके छोटे किनारे से 3 सेमी की दूरी पर एक साधारण पेंसिल से एक क्षैतिज रेखा खींचें। फिर इसे संलग्न आरेख के अनुसार असमान खंडों में विभाजित किया जाता है और मानक और परीक्षण मिश्रण के अनुप्रयोग की सीमाओं को तीरों से चिह्नित किया जाता है और संबंधित शिलालेख एक साधारण पेंसिल से बनाए जाते हैं।

कागज को टेबल की सतह के ऊपर मजबूत किया जाता है और मानक मिश्रण को पहले एक पतली रेखा में एक विशेष माइक्रोपिपेट का उपयोग करके तीरों द्वारा सीमित शुरुआती लाइन पर लगाया जाता है, जब तक कि माइक्रोपिपेट से पूरा समाधान शुरुआती लाइन (माइक्रोपिपेट) में स्थानांतरित नहीं हो जाता है। 2-3 सेमी तक भरा हुआ)। लगाए गए घोल का द्रव्यमान मानक मिश्रण से भरे पिपेट (घोल लगाने से पहले) और खाली (समाधान लगाने के बाद) को तौलकर मापा जाता है। आमतौर पर कागज पर 0.02-0.03 ग्राम मानक घोल लगाया जाता है। फिर एक साफ पिपेट में अमीनो एसिड (अध्ययन के लिए शिक्षक द्वारा जारी किया गया) का परीक्षण मिश्रण भरें, इसे तौलें और मिश्रण को उचित निशान के साथ शुरुआती लाइन पर लगाएं।

तैयार क्रोमैटोग्राम को एक क्रोमैटोग्राफी कक्ष में रखा जाता है, जिसमें अमीनो एसिड के मिश्रण को अलग करने के लिए पहले से एक विलायक प्रणाली डाली जाती है, उदाहरण के लिए, 15: 3: 7 के अनुपात में ब्यूटेनॉल, एसिटिक एसिड और पानी का मिश्रण। आरोही क्रोमैटोग्राफी द्वारा पृथक्करण तब तक किया जाता है जब तक कि सामने की रेखा क्रोमैटोग्राफी पेपर (फिनिश लाइन) के शीर्ष किनारे तक 2-3 सेमी तक नहीं पहुंच जाती। इसके बाद, क्रोमैटोग्राम को चैम्बर से हटा दिया जाता है और कागज के ऊपरी सिरे को तुरंत रबर की अंगूठी से बंधे तीन कांच की छड़ों से बने धारक में डाला जाता है और कागज से सॉल्वैंट्स को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए धूआं हुड में रखा जाता है।

चावल। 8. क्रोमैटोग्राम पर अमीनो एसिड की व्यवस्था की योजना:

ए - अमीनो एसिड के मिश्रण के अनुप्रयोग का बिंदु; मैं - सिस्टीन और सिस्टीन;

2 - लाइसिन; 3 - हिस्टिडीन; 4 - आर्जिनिन; 5 - एसपारटिक एसिड,

श्रृंखला और ग्लाइसिन; 6 - ग्लुटामिक एसिडऔर थ्रेओनीन; 7 - अलैनिन;

8 - प्रोलाइन; 9 - टायरोसिन; 10 - वेलिन और मेथियोनीन; द्वितीय - ट्रिप्टोफैन;

12 - फेनिलएलनिन; 13 - ल्यूसीन और आइसोल्यूसीन

सूखे क्रोमैटोग्राम को उस पर अमीनो एसिड स्पॉट की स्थिति का पता लगाने के लिए एसीटोन में निनहाइड्रिन के 1% घोल में डुबोया जाता है। एसीटोन को हटाने के लिए क्रोमैटोग्राम को 10 मिनट के लिए धूआं हुड में रखा जाता है और एक सुखाने वाले कैबिनेट में स्थानांतरित किया जाता है, जहां इसे 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है। मानक और परीक्षण मिश्रण के अमीनो एसिड प्रारंभिक रेखा से क्रोमैटोग्राम के ऊपरी किनारे तक विलायक प्रणाली की गति की दिशा में एक श्रृंखला में स्थित नीले-बैंगनी धब्बों के रूप में पाए जाते हैं।

परीक्षण मिश्रण में निहित अमीनो एसिड की पहचान मानक और परीक्षण मिश्रण (छवि 8) के अमीनो एसिड द्वारा कब्जा किए गए पदों के क्रोमैटोग्राम में संयोग से की जाती है।

परीक्षण मिश्रण में अमीनो एसिड की मात्रात्मक सामग्री निर्धारित करने के लिए, क्रोमैटोग्राम को एक साधारण पेंसिल से खींचा जाता है ताकि समान स्तर पर पड़े रंगीन क्षेत्र, समान अमीनो एसिड के अनुरूप, लगभग समान आयतों में समाहित हो जाएं (चित्र 9) .

मैं द्वितीय तृतीय चतुर्थ

चावल। 9. क्रोमैटोग्राम पर अमीनो एसिड का लेआउट:

मैं - मिश्रण संख्या I; द्वितीय - मिश्रण संख्या 2; 1यू - मिश्रण संख्या 3; Ш - मानक

अमीनो एसिड मिश्रण

कागज के रेखांकित क्षेत्रों को काटकर परीक्षण ट्यूबों में रखा जाता है, जिनकी संख्या क्रोमैटोग्राम पर धब्बों की संख्या के अनुरूप होनी चाहिए। ब्यूरेट से प्रत्येक परखनली में 75% घोल का 10 मिलीलीटर डाला जाता है। एथिल अल्कोहोलशहद सल्फेट से संतृप्त (500 मिली एथिल अल्कोहल में 0.2 मिली संतृप्त कॉपर सल्फेट घोल मिलाएं)। टेस्ट ट्यूब को ढक दिया जाता है और, कभी-कभी हिलाते हुए, ईंट-लाल रंग (रूहेमैन नीला-बैंगनी तांबा नमक) पूरी तरह से कागज से समाधान में स्थानांतरित हो जाता है। इसमें 15-20 मिनट का समय लगता है. मानक और परीक्षण समाधानों का अवशोषण (ऑप्टिकल घनत्व) हरे प्रकाश फिल्टर (540 एनएम) के साथ एक फोटोइलेक्ट्रिक कैलोरीमीटर पर मापा जाता है। संदर्भ प्रवाह में कॉपर सल्फेट के साथ एथिल अल्कोहल के 75% घोल वाला एक क्युवेट स्थापित किया गया है।

परीक्षण समाधान में अमीनो एसिड की मात्रात्मक सामग्री की गणना परीक्षण और मानक नमूनों के विलुप्त होने के अनुपात से की जाती है।

गणना उदाहरण. आइए मान लें कि मानक मिश्रण में 1 मिलीलीटर में 1.8 मिलीग्राम ग्लाइसीन होता है, और इस मानक समाधान का 0.02 ग्राम शुरुआती पट्टी पर लगाया जाता है। इसलिए, क्रोमैटोग्राम प्राप्त हुआ (1.8 × 0.02) = 0.036 मिलीग्राम ग्लाइसिन। आइए हम आगे सहमत हों कि रंगीन घोल का अवशोषण मानक के लिए 0.288 और अज्ञात मिश्रण के लिए 0.336 था। फिर अध्ययन के तहत मिश्रण में ग्लाइसिन सामग्री, क्रोमैटोग्राम पर अंकित, (36´0.336): 0.288=42 माइक्रोग्राम होगी। यदि हम आगे यह मान लें कि परीक्षण मिश्रण को क्रोमैटोग्राम पर, उदाहरण के लिए, 0.0250 ग्राम की मात्रा में लागू किया जाता है, तो परीक्षण समाधान के 1 मिलीलीटर में ग्लाइसीन सामग्री (42: 0.0250) = 1680 μg, या 1.68 मिलीग्राम / होगी एमएल.

अपने स्वयं के प्रयोग के परिणाम प्रस्तुत करें और उनसे निष्कर्ष निकालें।

प्रयोगशाला कार्य संख्या 15

आयन पृथक्करणफ़े 3+ , सह 2+ , नी 2+

रंग प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके अमीनो एसिड का पता लगाया जा सकता है: निनहाइड्रिन, ज़ैंथोप्रोटीन, फोली, मिलोन, ब्यूरेट परीक्षण, आदि। ये प्रतिक्रियाएं गैर-विशिष्ट हैं, क्योंकि अमीनो एसिड की संरचना में अलग-अलग टुकड़ों का पता लगाने पर आधारित हैं, जो अन्य यौगिकों में भी पाए जा सकते हैं।

निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया, एक रंग प्रतिक्रिया जिसका उपयोग अमीनो एसिड, इमिनो एसिड और एमाइन के गुणात्मक और मात्रात्मक निर्धारण के लिए किया जाता है। क्षारीय वातावरण में गर्म करने पर, निनहाइड्रिन (ट्राइसिटोहाइड्रिन डिहाइड्रेट, सी 9 एच बी ओ 4) को प्राथमिक अमीनो समूह (-एनएच 2) वाले पदार्थों के साथ, एक उत्पाद बनता है जिसमें अधिकतम अवशोषण के साथ एक स्थिर तीव्र नीला-बैंगनी रंग होता है 570 एनएम. चूँकि इस तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण मुक्त अमीनो समूहों की संख्या पर रैखिक रूप से निर्भर करता है, निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया वर्णमिति या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा उनके मात्रात्मक निर्धारण के आधार के रूप में कार्य करती है। इस प्रतिक्रिया का उपयोग इमिनो एसिड - प्रोलाइन और हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन में माध्यमिक अमीनो समूहों (>एनएच) को निर्धारित करने के लिए भी किया जाता है; इस मामले में, एक चमकीला पीला उत्पाद बनता है। संवेदनशीलता - 0.01% तक. आधुनिक स्वचालित अमीनो एसिड विश्लेषण अमीनो एसिड के आयन एक्सचेंज पृथक्करण और निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया का उपयोग करके उनके मात्रात्मक निर्धारण को मिलाकर किया जाता है। पेपर क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके अमीनो एसिड के मिश्रण को अलग करते समय, प्रत्येक अमीनो एसिड को कम से कम 2-5 μg की मात्रा में निर्धारित करना संभव हो जाता है।

रंग की तीव्रता का उपयोग अमीनो एसिड की मात्रा का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

यह प्रतिक्रिया न केवल मुक्त अमीनो एसिड के साथ, बल्कि पेप्टाइड्स, प्रोटीन आदि के साथ भी सकारात्मक है।

ज़ैंथोप्रोटीन प्रतिक्रियाआपको पता लगाने की अनुमति देता है सुगंधित अमीनो एसिड(फेनिलएलनिन, टायरोसिन, हिस्टिडाइन, ट्रिप्टोफैन), सुगंधित रिंग (नाइट्रेशन) में इलेक्ट्रोफिलिक प्रतिस्थापन की प्रतिक्रिया पर आधारित है।

जब सांद्र नाइट्रिक एसिड कार्य करता है, उदाहरण के लिए, टायरोसिन पर, तो एक पीले रंग का उत्पाद बनता है।

फोलो प्रतिक्रिया.यह सिस्टीन और सिस्टीन की प्रतिक्रिया है। क्षारीय हाइड्रोलिसिस के दौरान, सिस्टीन और सिस्टीन में "कमजोर रूप से बाध्य सल्फर" काफी आसानी से अलग हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हाइड्रोजन सल्फाइड बनता है, जो क्षार के साथ प्रतिक्रिया करके सोडियम या पोटेशियम सल्फाइड का उत्पादन करता है। जब लेड (II) एसीटेट मिलाया जाता है, तो लेड (II) सल्फाइड का एक भूरा-काला अवक्षेप बनता है।

अनुभव का वर्णन. एक परखनली में 1 मिली सिस्टीन घोल डाला जाता है, 0.5 मिली 20% सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल मिलाया जाता है। मिश्रण को उबलने तक गर्म किया जाता है, और फिर 0.5 मिली लेड (II) एसीटेट घोल मिलाया जाता है। लेड (II) सल्फाइड का एक धूसर-काला अवक्षेप देखा गया है:

ज़िम्मरमैन प्रतिक्रिया.यह अमीनो एसिड ग्लाइसिन की प्रतिक्रिया है।

अनुभव का वर्णन. 0.1% ग्लाइसिन घोल के 2 मिलीलीटर में, पीएच = 8 पर 10% क्षार घोल मिलाकर समायोजित किया जाता है, ओ-फ्थेलिक डायल्डिहाइड के 0.5 मिलीलीटर जलीय घोल को मिलाया जाता है। प्रतिक्रिया मिश्रण धीरे-धीरे चमकीले हरे रंग में बदलने लगता है। कुछ मिनटों के बाद, एक हरा अवक्षेप दिखाई देता है।

ट्रिप्टोफैन पर प्रतिक्रिया.ट्रिप्टोफैन प्रतिक्रिया करता है अम्लीय वातावरणएल्डिहाइड के साथ, रंगीन संघनन उत्पाद बनाता है। उदाहरण के लिए, ग्लाइऑक्सिलिक एसिड के साथ (जो सांद्र का मिश्रण है एसीटिक अम्ल) प्रतिक्रिया समीकरण के अनुसार आगे बढ़ती है:

फॉर्मेल्डिहाइड के साथ ट्रिप्टोफैन की प्रतिक्रिया एक समान योजना के अनुसार होती है।

सकागुची की प्रतिक्रिया.अमीनो एसिड आर्जिनिन के प्रति यह प्रतिक्रिया ऑक्सीकरण एजेंट की उपस्थिति में α-नैफ्थोल के साथ आर्जिनिन की परस्पर क्रिया पर आधारित है। इसका तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। जाहिर है, प्रतिक्रिया निम्नलिखित समीकरण के अनुसार की जाती है:

चूंकि क्विनोनिमाइन डेरिवेटिव (में इस मामले मेंनैफ्थोक्विनोन), जिसमें इमिनो समूह -NH- के हाइड्रोजन को एल्काइल या एरिल रेडिकल द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, हमेशा पीले-लाल रंग में रंगे होते हैं, फिर, जाहिरा तौर पर, नारंगी-लाल रंगसकागुची प्रतिक्रिया के दौरान समाधान को नैफ्थोक्विनोन इमाइन व्युत्पन्न की उपस्थिति द्वारा समझाया गया है। हालाँकि, आर्गिनिन अवशेषों के शेष एनएच समूहों और α-नैफ्थोल के बेंजीन रिंग के आगे ऑक्सीकरण के कारण और भी अधिक जटिल यौगिक के निर्माण की संभावना से इंकार नहीं किया जा सकता है:

अनुभव का वर्णन. 0.01% आर्जिनिन घोल के 2 मिलीलीटर को एक परखनली में डाला जाता है, फिर 10% सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल के 2 मिलीलीटर और 0.2% अल्कोहल घोल α-नेफ्थॉल की कुछ बूंदें डाली जाती हैं। टेस्ट ट्यूब की सामग्री को अच्छी तरह मिलाया जाता है, 0.5 मिलीलीटर हाइपोब्रोमाइट घोल मिलाया जाता है और फिर से मिलाया जाता है। तेजी से विकसित हो रहे नारंगी-लाल रंग को स्थिर करने के लिए तुरंत 40% यूरिया घोल का 1 मिलीलीटर मिलाएं।

ब्यूरेट प्रतिक्रिया- प्रोटीन के प्रति रंग प्रतिक्रिया के रूप में उपयोग किया जाता है। क्षारीय वातावरण में तांबे (II) लवण की उपस्थिति में, वे बैंगनी रंग देते हैं। यह रंग पेप्टाइड समूह के कारण कॉपर (II) जटिल यौगिक के निर्माण के कारण होता है -सीओ-एनएच-, जो प्रोटीन की विशेषता है। इस प्रतिक्रिया को इसका नाम यूरिया व्युत्पन्न - ब्यूरेट से मिला है, जो अमोनिया के उन्मूलन के साथ यूरिया को गर्म करने पर बनता है:

प्रोटीन और ब्यूरेट के अलावा, समान रंग इस समूह वाले अन्य यौगिकों द्वारा दिया जाता है: एमाइड्स, कार्बोक्जिलिक एसिड के इमाइड्स, साथ ही अणु में -CS-NH- या =CH-NH- समूह वाले यौगिक। प्रोटीन, कुछ अमीनो एसिड, पेप्टाइड्स, ब्यूरेट और मध्यम पेप्टोन भी प्रतिक्रिया करते हैं।

विभिन्न पेप्टाइड्स के साथ ब्यूरेट प्रतिक्रिया द्वारा प्राप्त कॉम्प्लेक्स का रंग कुछ अलग होता है और पेप्टाइड श्रृंखला की लंबाई पर निर्भर करता है। चार अमीनो एसिड अवशेषों और उससे ऊपर की श्रृंखला की लंबाई वाले पेप्टाइड्स एक लाल कॉम्प्लेक्स बनाते हैं, ट्रिपेप्टाइड्स - बैंगनी, और डाइपेप्टाइड्स - नीला।

पॉलीपेप्टाइड का कीटोन रूप

पॉलीपेप्टाइड का एनोल रूप

जब एक पॉलीपेप्टाइड Cu (OH) 2 के साथ परस्पर क्रिया करता है, तो एक कॉम्प्लेक्स बनता है, जिसकी संरचना निम्नानुसार दिखाई जा सकती है।