Cet article discutera des méthodes de détermination des acides aminés, utilisées non seulement dans l'analyse des produits, mais aussi en biochimie et en analyse pharmaceutique.
La quantité totale d'acides aminés peut être déterminée par une méthode photométrique basée sur la détermination de l'ammoniac obtenu à partir des acides aminés selon la méthode Kjeldahl.
Réaction avec le 1-naphtol. Pour déterminer l'arginine, l'histidine et la tyrosine, une réaction avec le 1-naphtol a été proposée. En présence d'hypochlorite de sodium (NaOCl), la solution devient rouge. Une solution échantillon dans de l'éthanol à 50 % contenant un acide aminé est refroidie avec de la glace et une solution de NaOCl à 10 % et une solution de naphtol sont ajoutées. Le produit de la réaction est coloré en rouge (l max = 550 nm). La teneur en acides aminés est déterminée par l'intensité de la couleur de la solution obtenue.
Réaction de Biuret. L'une des réactions les plus importantes utilisées pour déterminer les acides aminés est la réaction du biuret. La réaction est réalisée en ajoutant du biuret dilué à une solution alcaline solution aqueuse sels de cuivre(II). Dans ce cas, la solution devient violet intense en raison de la formation d’un composé complexe.
La réaction du biuret implique des composés contenant au moins 2 groupes amide ou un groupe aminohydroxyéthylène, ainsi que des amides et imides d'acides aminés. Cette réaction est réalisée par des protéines et des solutions concentrées d'acides aminés et d'amides. Les solutions diluées d'acides aminés ne donnent pas de réaction de biuret et la réaction peut donc être utilisée pour déterminer la fin de l'hydrolyse des protéines. La réaction est également utilisée pour la détermination qualitative et quantitative des protéines. La réaction du biuret est à la base des méthodes utilisées dans les laboratoires de diagnostic clinique pour déterminer les protéines dans le sang et d'autres fluides biologiques.
Réaction à la ninhydrine. La deuxième réaction la plus importante utilisée pour déterminer les acides aminés est la réaction de la ninhydrine - une réaction colorée en acides aminés a, qui est réalisée en chauffant ces derniers dans solution alcaline excès de ninhydrine.
La ninhydrine effectue une décarboxylation oxydative des acides aminés a avec formation d'ammoniac, gaz carbonique et un aldéhyde contenant un atome de carbone de moins que l'acide aminé parent. La ninhydrine réduite réagit en outre avec l'ammoniac libéré et une seconde molécule de ninhydrine, formant un produit de condensation coloré avec l'ammoniac.
Le composé (pigment) obtenu a une couleur bleu-violet (l max = 570 nm). La formation de ce composé coloré est utilisée dans le test quantitatif des acides aminés a, qui peut détecter des acides aminés même en quantités aussi petites que 1 µg.
La proline et l'hydroxyproline, qui n'ont pas de groupe a-amino, réagissent avec la ninhydrine pour former des dérivés couleur jaune(lmax = 440 nm). La réaction n'est pas spécifique, car l'ammoniac et les composés contenant un groupe amino (amines, protéines, peptides) produisent également un produit coloré avec la ninhydrine. Cependant, aucun CO 2 n'est libéré avec ces composés. La libération de dioxyde de carbone n'est caractéristique que des acides aminés alpha. La réaction est utilisée pour la détermination quantitative colorimétrique des acides aminés a, y compris dans les analyseurs automatiques d'acides aminés (mesure du volume de CO 2).
La réaction à la ninhydrine est utilisée pour déterminer la glycine, l'isoleucine, la leucine ; la sérine, la phénylalanine, la cystéine, la tyrosine, le tryptophane, etc. donnent une coloration moins intense.
Les produits obtenus sont caractérisés par une couleur assez intense (e = 1,8–3,3·10 4), mais les produits colorés sont instables. L'intensité de la couleur diminue rapidement. CdCl 2 est ajouté pour la stabilisation. Il forme des complexes stables avec les composés résultants. Le chlorure de cadmium accélère également la réaction.
Les acides aminés et certains autres composés contenant un groupe amino se condensent en environnement alcalin avec la 1,2-naphtoquinone - 4-sulfoxylot pour former des dérivés rouges, jaunes et oranges de la 1,2-naphtoquinone monoimine.
La réaction permet de doser les a-aminoxylates (valine, isoleucine, leucine, etc.).
Pour déterminer le tryptophane, la réaction avec le 4-diméthylaminobenzaldéhyde peut être utilisée. Le produit de la réaction est violet et la teneur en tryptophane de la solution analysée est déterminée par l'intensité de la couleur.
Il convient toutefois de noter que cette réaction est rarement utilisée en analyse alimentaire.
Pour le dosage quantitatif des acides aminés contenant du soufre, une méthode bromatométrique est utilisée, basée sur la réaction suivante :
Une solution de cystéine dans une solution de NaOH à 1% est versée dans un ballon avec un bouchon rodé, 0,1 N est ajouté. solution de bromate de potassium, bromure de potassium sec et acidifié avec 10% HCl.
BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O
Le brome formé à la suite de la réaction, dont la quantité est équivalente à la quantité de bromate de potassium, réagit avec l'acide aminé. Après 10 minutes, de l'iodure de potassium est ajouté, qui réagit avec le brome n'ayant pas réagi, et l'iode libéré est titré avec 0,1 N. solution de thiosulfate de sodium avec de l'amidon comme indicateur.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
La quantité de thiosulfate utilisée pour le titrage est équivalente à la quantité de brome qui n'a pas réagi avec l'acide aminé. Sur la base de la différence entre la quantité de bromate de potassium et de thiosulfate ajoutés, on trouve la quantité de brome qui est entrée dans la réaction avec l'acide aminé, et donc la quantité d'acide aminé.
La méthionine est déterminée de la même manière. La méthionine est oxydée en sulfone :
Cette réaction quand certaines conditions permet de déterminer très précisément la teneur en méthionine.
Méthodes de détermination des acides aminés
Les acides aminés sont biologiquement substances actives, ils jouent un rôle important dans la vie du corps humain, ils sont largement utilisés comme médicaments. Certains d’entre eux sont essentiels et pénètrent dans l’organisme avec la nourriture. Actuellement, il existe un certain nombre de méthodes pour la détermination quantitative des acides aminés dans les matières végétales médicinales, notamment médicaments et fluides biologiques, dans les produits alimentaires.
Parmi la variété des méthodes de détermination quantitative des acides aminés dans divers objets, on peut distinguer quatre groupes principaux : les méthodes d'analyse chromatographiques, spectrophotométriques, titrimétriques et électrochimiques.
Méthodes chromatographiques
Au cours des dernières décennies, des progrès significatifs ont été réalisés dans le domaine de la chromatographie gaz-liquide des acides aminés. Une méthode utilisant des colonnes micro-garnies a été proposée, qui permet une un bref délais sépare presque complètement 17 acides aminés α biologiquement importants.
Une méthode a été développée pour la détermination des acides aminés par chromatographie gaz-liquide dans des échantillons de sérum, plasma, urine et liquide cérébro-spinal, basé sur la préparation d'éthers de 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl-isobutyle suivie d'une séparation sur une colonne de polydiméthylsiloxane en mode programmation de température de 140°C à 250°C avec un détecteur à ionisation de flamme. Le temps de séparation chromatographique est de 28 minutes. À la suite de la recherche, 27 acides aminés ont été séparés.
Malgré la variété des méthodes de chromatographie liquide haute performance pour l'analyse des acides aminés, la plus rapide et la plus accessible est la version en phase inverse avec détection spectrophotométrique. Pour une séparation et une détection réussies, les acides aminés sont convertis en dérivés hydrophobes et absorbant la lumière, c'est-à-dire qu'une dérivatisation pré-colonne est effectuée. L'aldéhyde orthophtalique, le naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde et le 9-fluorénylméthylchloroformate sont utilisés comme réactifs de dérivatisation.
Une méthode a été développée pour la détermination quantitative de la L-cystine, de l'acide L-glutamique et de la glycine dans le médicament "Eltacin", qui possède une activité antioxydante en combinaison avec un effet anti-angineux. L'acide glutamique et la glycine ont été déterminés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse après dérivatisation pré-colonne avec le réactif orthophtaliquedéhyde/N-acétyl-L-cystéine. Selon les auteurs, la dérivatisation de la cystéine est difficile en raison de l'instabilité de l'acide aminé lui-même et des dérivés qui en résultent. Par conséquent, l’analyse de la cystéine a été réalisée par titrage bromatométrique. Il a été constaté que la présence de quantités significatives de cystéine dans l'échantillon n'interfère pas avec la détermination des produits de dérivatisation de la glycine et de l'acide glutamique avec le réactif aldéhyde orthophtalique/N-acétyl-L-cystéine. La méthode se caractérise par une reproductibilité et une précision de détermination élevées.
La possibilité d'utiliser la 4,7-phénanthroline-5,6-dione (phanquinone) comme réactif de marquage fluorogénique pour la formation de pré-colonnes de ses dérivés à des fins de séparation et d'analyse quantitative des acides aminés par chromatographie liquide à haute performance a été enquêté. N'ayant pas de fluorescence intrinsèque, la fanquinone réagit avec les groupements aminés des acides aminés (à 68 °C pendant 160 min), formant des iminoquinols dont la fluorescence est mesurée à une longueur d'onde de 460 nm. Les dérivés isolés ont été identifiés par les spectres Tm, IR, de masse et PMR. Une chromatographie liquide haute performance a été réalisée sur un chromatographe avec un détecteur fluorescent et une colonne à élution en gradient avec des mélanges : solution de triéthylamine - tampon phosphate (pH 3) - méthanol. La quinidine a été utilisée comme étalon interne. Cette méthode très prometteur dans les grands laboratoires et peut être proposé pour l’analyse des acides aminés dans les formes galéniques finies.
Une technique de chromatographie liquide haute performance avec un biocapteur potentiométrique pour le dosage quantitatif de la lysine a été développée. Le biocapteur est construit en fixant une membrane contenant de la lysine oxydase à une électrode NH4+ sélective aux ions. Les ions ammonium générés lors de la dégradation enzymatique de la lysine sont détectés de manière potentiométrique. Une méthode chromatodensitométrique expresse pour l’analyse du tryptophane dans les liquides de culture a été développée. Une chromatographie sur couche mince a été réalisée sur plaques Sorbfil. La Chromatographie a été réalisée dans le système propanol-2 - solution d'hydroxyde d'ammonium à 25 % (7:3) pendant 25 minutes. Les chromatogrammes ont été séchés à température ambiante et conservés à 120°C pendant 15 min. Pour détecter les taches sur les chromatogrammes, un réactif spécifique a été utilisé - le 4-diméthylaminobenzaldéhyde, sélectif du cycle indole du tryptophane, sous la forme d'une solution d'éthanol à 0,5% additionnée d'acide sulfurique concentré à 5%. Après avoir développé les chromatogrammes par immersion dans une cuvette en Téflon avec une solution fraîchement préparée de 4-diméthylaminobenzaldéhyde, ils ont été conservés 5 à 7 minutes à une température de 110°C. La numérisation des taches de tryptophane a été réalisée à une longueur d'onde de 625 nm sur un densitomètre vidéo informatique. La méthode développée, malgré haute précision définitions et performances, spécifiques au tryptophane.
Pour l’analyse des acides β-aminés dans les fluides biologiques, les médicaments et les produits alimentaires, les méthodes d’électrophorèse capillaire basées sur la séparation des composants sont largement utilisées. mélange complexe dans un capillaire de quartz sous l'action de champ électrique. Étant donné que les acides aminés sont de nature zwittérionique, ils peuvent être séparés à l'aide de solutions tampons électrolytiques avec une valeur de pH appropriée, le plus souvent des tampons de séparation neutres et basiques sont utilisés.
Afin d'augmenter la spécificité et la sensibilité de la méthode d'électrophorèse capillaire pour l'analyse des acides β-aminés individuels, leur dérivatisation préliminaire est utilisée, suivie d'une séparation dans un capillaire à quartz et d'une détermination spectrophotométrique des produits de réaction. Ainsi, le formiate de 9-fluorénylméthyle, le chloroformiate de 9-(2-carbazole)-éthyle et le colorant cyanine sont utilisés comme agents de dérivatisation. Les perspectives de la méthode sont dues à des avantages tels qu'une analyse rapide, la facilité de préparation des échantillons, une faible consommation de réactifs et la simplicité de l'instrumentation.
Et les protéines
On sait que les 20 variétés d'acides α-aminés canoniques ont la même structure, avec trois variantes de groupes fonctionnels (Fig. 3.3). Malheureusement, les réactions aux groupes amino et carboxy ne sont pas très spécifiques, car en conséquence, ils sont caractéristiques de toutes les amines, d'un certain nombre d'amides et d'acides carboxyliques. Il en va de même pour la plupart de leurs radicaux = R, dont 10 sont apolaires, c'est-à-dire représentés par des groupes aliphatiques = hydrocarbures, dont la plupart sont chimiquement inertes. La spécificité de la plupart des acides aminés polaires R, qui contiennent des groupes alcool (Ser, Tre, Tyr), amide (Asn, Gln) et carboxy (Asp, Glu), est également relativement faible. Le groupe amino (Lys), l'imidazole His et le groupe guanidino Arg sont plus actifs et l'activité du groupe thio Cys est maximale. C'est pourquoi le plus grand importance pratique dans l'analyse qualitative et quantitative des acides α-aminés, y compris dans les analyseurs d'acides aminés, une réaction universelle à la ninhydrine a été obtenue, spécifique de la présence simultanée de groupes amino et carboxy au niveau de l'atome α-C.
Riz. 3.3. Formules générales structures des acides α-aminés et de leurs produits de polymérisation. Explications dans le texte.
La polymérisation des acides aminés α dans la structure des peptides et des protéines (Fig. 3.3) conserve tous leurs types R, mais :
1. La réaction à la ninhydrine devient négative, car à l'exception des groupes N- et C-terminaux, les groupes α-amino et α-carboxy sont consacrés à la formation de liaisons peptidiques. Une réaction positive de la ninhydrine avec la protéine indique très probablement la présence d'impuretés d'acides aminés dans la préparation ou le récipient.
2. Pour tous les peptides et protéines, une réaction de biuret est spécifique à un groupe peptidique absent dans les acides aminés monomères.
3. Parmi les réactions plus spécifiques aux acides aminés R, les suivantes sont utiles : réaction de xanthoprotéine avec de l'acide nitrique concentré, en R aromatiques Fen, Tyr, Tri ; réaction avec l'isatine sur le cycle Pro à cinq chaînons, ainsi que des réactions sur l'imidazole R His, le groupe thio Cys et le groupe guanidino Arg. Il est important de considérer que certains de ces R sont cachés à l’intérieur de globules protéiques et donc réactions qualitatives affaibli sur eux. Par conséquent, avant leur réalisation, les protéines sont généralement dénaturées d’une manière ou d’une autre.
4. Contrairement aux vraies solutions d'acides aminés, les solutions colloïdales de protéines sont caractérisées réactions sédimentaires, associés à la destruction de leurs coques d'hydratation et, par conséquent, à une diminution de leur solubilité sous l'influence d'agents déshydratants : sels neutres = relargage, méthanol = MeOH, éthanol = EtOH, acétone, urée et autres agents.
Lorsque vous effectuez des réactions qualitatives, vous devez :
1. Suivez attentivement les règles la sécurité incendie et travailler avec des acides et des alcalis concentrés = EZh.
2. Marquez 2 rangées de tubes à essai avec un graphique en verre ou un feutre et ne placez pas plus de 0,5 ml (2 à 5 gouttes) d'une solution d'acides aminés à 1 % dans l'une d'elles, et environ le même volume d'un 1 % de solution d'acides aminés. % de solution protéique dans l'autre.
3. Dans une paire de tubes à essai contenant des solutions d'acides aminés et de protéines, ajoutez en parallèle 3 à 5 gouttes des réactifs correspondants et effectuez les procédures restantes indiquées pour la réaction correspondante.
4. S'il est nécessaire de chauffer les tubes à essai, retirez le couvercle du creuset et allumez le combustible sec avec une allumette. Ensuite, fixez le tube à essai dans un support dont la conception primitive est très peu fiable. Par conséquent, il est préférable d'envelopper quelques tubes à essai avec un morceau de papier plié en bandes et de les tenir pouce, passe uniformément moitiés inférieures des tubes à essai à travers la flamme, éviter de pointer le cou vers les voisins et de faire bouillir violemment la solution. Après avoir terminé l'opération, éteignez rapidement la flamme avec le couvercle du creuset.
5. Les résultats des expérimentations, conformément au modèle, sont établis sur la diffusion du cahier de laboratoire sous forme de tableau :
6. Après avoir examiné les résultats obtenus et terminé le protocole, ainsi qu'un support de tubes à essai, présentez-les à l'enseignant pour protection.
1. Réaction à la ninhydrine. Basé sur la désamination et la décarboxylation des acides α-aminés avec une solution alcoolique de ninhydrine :
L'ammoniac résultant, réagissant avec deux molécules de ninhydrine, forme un dérivé coloré avec un maximum d'absorption à 540 nm (pour Pro - 440 nm).
Progrès: Ajouter 3 à 5 gouttes de 0,5 % aux échantillons de test solution d'alcool ninhydrine. Chauffez doucement les tubes à essai avec les mélanges sur une flamme et après 2-3 minutes enregistrez l'apparition de la couleur.
2. Réaction xanthoprotéique. Comme mentionné ci-dessus, il repose sur la formation de dérivés nitro d'acides aminés à R aromatiques : Fen, Tyr, Tri.
Progrès: En ouvrant le tirage de la sorbonne, ajoutez délicatement quelques gouttes d'acide nitrique concentré (HNO 3) dans une paire de tubes à essai contenant les solutions d'essai. Chauffez doucement les tubes à essai sur une flamme, en évitant de pointer le cou vers les voisins, et enregistrez l'évolution de la couleur.
3. Réaction nitroprussiate. Il est basé sur l'hydrolyse alcaline de l'acide aminé soufré cystéine, avec libération de sulfure de sodium (Na 2 S), qui donne un complexe rouge avec une solution fraîchement préparée de nitroprussiate de sodium.
Progrès: Ajoutez 5 à 10 gouttes de solutions de test dans les deux tubes à essai volume égal 20 % soude caustique et faire bouillir pendant au moins 3 à 5 minutes. Ajoutez 3 à 5 gouttes de solution de nitroprussiate de sodium dans les tubes à essai et enregistrez l'évolution de la couleur.
4. Réaction de Biuret. Il est basé sur la formation d'un complexe coloré d'une liaison peptidique avec un ion Cu 2+ dans un environnement alcalin. Sert de test universel pour identifier les peptides et les protéines dans les solutions. Étant donné qu'avec l'augmentation du nombre de liaisons peptidiques, l'intensité de la couleur de la solution augmente de manière linéaire, elle est largement utilisée pour la détermination photométrique des concentrations de protéines.
Progrès. Ajoutez la même quantité de solution d'hydroxyde de sodium à 10 % dans des tubes à essai avec 5 à 10 gouttes de solutions d'essai. Bien mélanger et ajouter 2 gouttes d'une solution de sulfate de cuivre à 1% (CuSO 4). Mélangez les échantillons et enregistrez l’évolution des couleurs après quelques minutes.
5. Test d'ébullition. Basé sur la dénaturation thermique des protéines.
Progrès. Acidifiez les deux tubes à essai avec les solutions d’essai contenant au maximum une goutte de solution d’acide acétique à 1 % (AcOH) et chauffez jusqu’à ébullition. Après avoir fait bouillir les solutions pendant 2-3 minutes, enregistrez les résultats et expliquez le mécanisme du phénomène.
6. Précipitation par les sels de métaux lourds(Meh) . Leurs propriétés dénaturantes reposent sur la capacité des cations Me lourds à réagir avec les groupes fonctionnels R de la molécule protéique : thio-, amino-, carboxy-, aromatique. De plus, leurs anions forts provoquent la recharge des groupes ioniques dans les molécules protéiques, détruisant ainsi les liaisons ioniques qu'elles contiennent.
Progrès. Ajoutez quelques gouttes d'une solution de sulfate de cuivre à 5 % (CuSO 4) dans les deux tubes à essai contenant les solutions de test. Enregistrez et expliquez les résultats obtenus.
7. Précipitation avec des acides organiques. Basé sur la dénaturation acide des protéines et la formation de dérivés covalents de groupes thio-, amino- et aromatiques d'acides aminés R avec des organochlorés.
Progrès. Ajoutez quelques gouttes d'une solution à 10 % d'acide trichloroacétique (TCA) dans les tubes à essai contenant les solutions d'essai et, après quelques minutes, enregistrez les résultats.
Matériel et réactif : papier de chromatographie; chambre de chromatographie ; colorimètre photoélectrique; ciseaux; assiettes en verre (3´32 cm) - 3 pièces ; support pour chromatogrammes; armoire de séchage; micropipettes; tubes à essai avec bouchons rodés; burette 25 ml; mélange standard d'acides aminés; tester le mélange d’acides aminés ; butanol, acide acétique, eau dans un rapport de 15:3:7 ; Solution à 1 % de ninhydrine dans de l'acétone à 95 % ; alcool éthylique (75%), saturé de sulfate de cuivre.
Achèvement des travaux
Prenez une feuille de papier chromatographique mesurant 18 x 28 cm et tracez une ligne horizontale avec un simple crayon à une distance de 3 cm de son bord court. Ensuite, il est divisé en sections inégales conformément au schéma ci-joint et les limites d'application des mélanges étalon et test sont marquées par des flèches et les inscriptions correspondantes sont faites avec un simple crayon.
Le papier est renforcé au-dessus de la surface de la table et le mélange standard est d'abord appliqué sur la ligne de départ, limitée par les flèches, à l'aide d'une micropipette spéciale en un trait fin jusqu'à ce que toute la solution de la micropipette soit transférée vers la ligne de départ (la micropipette est rempli à 2-3 cm). La masse de la solution appliquée est mesurée en pesant la pipette remplie du mélange étalon (avant application de la solution) et vide (après application de la solution). 0,02 à 0,03 g de solution standard sont généralement appliqués sur le papier. Remplissez ensuite une pipette propre avec le mélange test d'acides aminés (délivré par l'enseignant pour l'étude), pesez-le et appliquez le mélange sur la ligne de départ avec la marque appropriée.
Le chromatogramme préparé est placé dans une chambre de chromatographie dans laquelle un système de solvants a été préalablement versé pour séparer un mélange d'acides aminés, par exemple un mélange de butanol, d'acide acétique et d'eau dans un rapport de 15:3:7. La séparation est réalisée par chromatographie ascendante jusqu'à ce que la ligne frontale atteigne 2-3 cm jusqu'au bord supérieur du papier de chromatographie (ligne d'arrivée). Après cela, le chromatogramme est retiré de la chambre et l'extrémité supérieure du papier est immédiatement insérée dans un support constitué de trois tiges de verre fixées par un anneau en caoutchouc et placée sous une sorbonne pendant 20 minutes pour éliminer les solvants du papier.
Riz. 8. Disposition des acides aminés sur le chromatogramme :
A - point d'application du mélange d'acides aminés ; I - cystine et cystéine ;
2 - lysine ; 3 - histidine; 4 - arginine ; 5 - acide aspartique,
série et glycine; 6 - acide glutamique et thréonine; 7 - alanine ;
8 - proline ; 9 - tyrosine ; 10 - valine et méthionine ; II - tryptophane ;
12 - phénylalanine; 13 – leucine et isoleucine
Le chromatogramme séché est plongé dans une solution à 1 % de ninhydrine dans l'acétone pour détecter la position des taches d'acides aminés dessus. Le chromatogramme est ensuite placé sous une sorbonne pendant 10 minutes pour éliminer l'acétone et transféré dans une étuve de séchage, où il est laissé pendant 15 minutes à 70°C. Les acides aminés des mélanges standard et test sont détectés sous la forme de taches bleu-violet situées en chaîne dans le sens de déplacement du système solvant depuis la ligne de départ jusqu'au bord supérieur du chromatogramme.
L'identification des acides aminés contenus dans le mélange test est réalisée par la coïncidence dans le chromatogramme des positions occupées par les acides aminés des mélanges standard et test (Fig. 8).
Pour déterminer la teneur quantitative en acides aminés dans les mélanges testés, le chromatogramme est dessiné avec un simple crayon de manière à ce que les zones colorées situées au même niveau, correspondant au même acide aminé, soient contenues dans des rectangles à peu près identiques (Fig. 9). .
I II III IV
Riz. 9. Disposition des acides aminés sur le chromatogramme :
I - mélange n° I ; II - mélange n°2 ; 1U - mélange n°3 ; Ø - standard
mélange d'acides aminés
Les zones de papier délimitées sont découpées et placées dans des tubes à essai dont les numéros doivent correspondre aux nombres de points sur les chromatogrammes. 10 ml d'une solution à 75 % sont versés dans chaque tube à essai à l'aide d'une burette. alcool éthylique saturé de sulfate de miel (ajouter 0,2 ml de solution saturée de sulfate de cuivre à 500 ml d'alcool éthylique). Le tube à essai est bouché et, en remuant de temps en temps, la couleur rouge brique (sel de cuivre bleu-violet de Ruheman) est entièrement transférée du papier à la solution. Cela prend 15 à 20 minutes. L'absorption (densité optique) des solutions étalon et test est mesurée sur un calorimètre photoélectrique doté d'un filtre de lumière verte (540 nm). Une cuvette contenant une solution à 75 % d'alcool éthylique avec du sulfate de cuivre est installée dans le flux de référence.
La teneur quantitative en acides aminés dans la solution d'essai est calculée à partir du rapport d'extinctions de l'échantillon à tester et de l'échantillon standard.
Exemple de calcul. Supposons que le mélange étalon contienne 1,8 mg de glycine dans 1 ml, et que 0,02 g de cette solution étalon soit appliqué sur la bandelette de départ. Ainsi, le chromatogramme reçu (1,8 × 0,02) = 0,036 mg de glycine. Convenons en outre que l'absorption des solutions colorées était de 0,288 pour l'étalon et de 0,336 pour le mélange inconnu. Alors la teneur en glycine dans le mélange étudié, reportée sur le chromatogramme, sera (36´0,336) : 0,288=42 µg. Si nous supposons en outre que le mélange à tester est appliqué au chromatogramme en une quantité de, par exemple, 0,0250 g, alors la teneur en glycine dans 1 ml de la solution à tester sera (42 : 0,0250) = 1 680 µg, soit 1,68 mg/ ml.
Présentez les résultats de votre propre expérience et tirez-en des conclusions.
Travail de laboratoire n°15
Séparation des ionsFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+
Les acides aminés peuvent être détectés à l'aide de réactions colorées : ninhydrine, xanthoprotéine, Foly, Milone, test du biuret, etc. Ces réactions sont non spécifiques, car sont basés sur la détection de fragments individuels dans la structure des acides aminés, que l'on retrouve également dans d'autres composés.
Réaction à la ninhydrine, une réaction colorée utilisée pour la détermination qualitative et quantitative des acides aminés, des iminoacides et des amines. Lorsqu'elle est chauffée dans un environnement alcalin, la ninhydrine (tricéthydrine déshydratée, C 9 H b O 4) avec des substances ayant des groupes amino primaires (-NH 2), il se forme un produit qui a une couleur bleu-violet intense et stable avec une absorption maximale d'environ 570 nm. L'absorption à cette longueur d'onde dépendant linéairement du nombre de groupes amino libres, la réaction de la ninhydrine a servi de base à leur détermination quantitative par colorimétrie ou spectrophotométrie. Cette réaction est également utilisée pour déterminer les groupes aminés secondaires (>NH) dans les acides imino - proline et hydroxyproline ; dans ce cas, un produit jaune vif se forme. Sensibilité - jusqu'à 0,01%. L'analyse automatique moderne des acides aminés est réalisée en combinant la séparation par échange d'ions des acides aminés et leur détermination quantitative à l'aide de la réaction à la ninhydrine. Lors de la séparation de mélanges d'acides aminés par chromatographie sur papier, cela permet de doser chaque acide aminé en une quantité d'au moins 2 à 5 µg.
L'intensité de la couleur peut être utilisée pour juger de la quantité d'acides aminés.
Cette réaction est positive non seulement avec les acides aminés libres, mais aussi avec les peptides, les protéines, etc.
Réaction xanthoprotéique permet de détecter acides aminés aromatiques(phénylalanine, tyrosine, histidine, tryptophane), basée sur la réaction de substitution électrophile dans le cycle aromatique (nitration).
Lorsque l'acide nitrique concentré agit, par exemple, sur la tyrosine, un produit de couleur jaune se forme.
Réaction folle. Il s'agit d'une réaction à la cystéine et à la cystine. Lors de l'hydrolyse alcaline, le « soufre faiblement lié » dans la cystéine et la cystine est assez facilement séparé, ce qui entraîne la formation de sulfure d'hydrogène qui, réagissant avec l'alcali, produit des sulfures de sodium ou de potassium. Lorsque de l’acétate de plomb (II) est ajouté, un précipité gris-noir de sulfure de plomb (II) se forme.
Description de l'expérience. 1 ml de solution de cystine est versé dans un tube à essai, 0,5 ml de solution de soude à 20 % est ajouté. Le mélange est chauffé jusqu'à ébullition, puis 0,5 ml de solution d'acétate de plomb(II) sont ajoutés. Un précipité gris-noir de sulfure de plomb(II) est observé :
Réaction de Zimmerman. Il s’agit d’une réaction à l’acide aminé glycine.
Description de l'expérience. A 2 ml d'une solution de glycine à 0,1 %, ajustée par ajout d'une solution alcaline à 10 % à pH = 8, ajouter 0,5 ml d'une solution aqueuse de dialdéhyde o-phtalique. Le mélange réactionnel commence lentement à virer au vert vif. Au bout de quelques minutes, un précipité vert apparaît.
Réaction au tryptophane. Le tryptophane réagit environnement acide avec les aldéhydes, forme des produits de condensation colorés. Par exemple, avec l'acide glyoxylique (qui est un mélange de concentré acide acétique) la réaction se déroule selon l'équation :
La réaction du tryptophane avec le formaldéhyde se déroule selon un schéma similaire.
La réaction de Sakaguchi. Cette réaction à l'acide aminé arginine est basée sur l'interaction de l'arginine avec l'α-naphtol en présence d'un agent oxydant. Son mécanisme n’est pas encore complètement élucidé. Apparemment, la réaction s'effectue selon l'équation suivante :
Puisque les dérivés de la quinonéimine (en dans ce cas naphtoquinone), dans lesquels l'hydrogène du groupe imino –NH– est remplacé par un radical alkyle ou aryle, sont toujours colorés en jaune-rouge, donc, apparemment, couleur rouge orangé solution lors de la réaction de Sakaguchi s'explique par l'apparition du dérivé naphtoquinone imine. Cependant, la possibilité de la formation d'un composé encore plus complexe en raison d'une oxydation ultérieure des groupes NH restants du résidu arginine et du cycle benzénique de l'α-naphtol ne peut être exclue :
Description de l'expérience. 2 ml d'une solution d'arginine à 0,01 % sont versés dans un tube à essai, puis 2 ml d'une solution de soude à 10 % et quelques gouttes d'une solution alcoolique d'α-naphtol à 0,2 % sont ajoutés. Le contenu du tube à essai est bien mélangé, 0,5 ml de solution d'hypobromite est ajouté et mélangé à nouveau. Ajouter immédiatement 1 ml de solution d'urée à 40 % pour stabiliser la couleur rouge orangé qui se développe rapidement.
Réaction de Biuret– utilisé comme réaction colorée aux protéines. En milieu alcalin en présence de sels de cuivre(II), ils donnent une couleur violette. La couleur est due à la formation d'un composé complexe de cuivre (II) dû au groupe peptidique -CO-NH-, ce qui est caractéristique des protéines. Cette réaction tire son nom d'un dérivé de l'urée - le biuret, qui se forme lorsque l'urée est chauffée avec élimination de l'ammoniac :
En plus des protéines et du biuret, la même coloration est donnée par d'autres composés contenant ce groupe : amides, imides d'acides carboxyliques, ainsi que les composés contenant les groupes -CS-NH- ou =CH-NH- dans la molécule. Les protéines, certains acides aminés, les peptides, le biuret et les peptones moyennes réagissent également.
La couleur du complexe obtenu par la réaction du biuret avec divers peptides est quelque peu différente et dépend de la longueur de la chaîne peptidique. Les peptides avec une longueur de chaîne de quatre résidus d'acides aminés et plus forment un complexe rouge, les tripeptides - violets et les dipeptides - bleus.
forme cétonique du polypeptide
forme énol du polypeptide
Lorsqu'un polypeptide interagit avec Cu (OH) 2, un complexe se forme dont la structure peut être représentée comme suit.
