सूक्ष्म जीव विज्ञान पर व्याख्यान "प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं। संक्रामक रोगों के निदान में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अनुप्रयोग।" व्याख्यान: एग्लूटिनेशन रिएक्शन (आरए)। तंत्र। अवयव। मंचन के तरीके. अनुप्रयोग एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया

एक एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया (आरए) एक इलेक्ट्रोलाइट की उपस्थिति में एंटीबॉडी के प्रभाव में रोगाणुओं या अन्य कोशिकाओं का आसंजन और अवक्षेपण है। परिणामी अवक्षेप को एग्लूटिनेट कहा जाता है।

आरए का उपयोग किया जाता है:

1. रोगी के रक्त सीरम (सेरोडायग्नोसिस) में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए।

2. एक रोगी (सीरोटाइपिंग) से पृथक रोगजनक सूक्ष्मजीवों की शुद्ध संस्कृति के प्रकार और सेरोवर का निर्धारण करना।

एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया का उपयोग रोगियों के रक्त सीरम में एंटीबॉडी निर्धारित करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए, टाइफाइड बुखार और पैराटाइफाइड बुखार (विडाल प्रतिक्रिया), ब्रुसेलोसिस (राइट, हेडलसन प्रतिक्रिया), टुलारेमिया, लेप्टोस्पायरोसिस और अन्य संक्रामक रोगों के साथ-साथ निर्धारित करने के लिए रोगी से अलग किया गया रोगज़नक़ (आंतों में संक्रमण, काली खांसी, आदि)। आरए का उपयोग रक्त समूह, आरएच कारक आदि निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता होती है:

1. एंटीजन (एग्लूटीनोजेन) कणिकायुक्त होना चाहिए, अर्थात यह जीवित या मारे गए सूक्ष्मजीवों (डायग्नोस्टिक्स एम), एरिथ्रोसाइट्स या अन्य कोशिकाओं का निलंबन है। आमतौर पर, अगर तिरछी सतह पर उगाए गए सूक्ष्मजीवों की दैनिक संस्कृति का उपयोग किया जाता है। संस्कृति को 3 - 4 मिलीलीटर आइसोटोनिक समाधान से धोया जाता है, एक बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है, और घनत्व निर्धारित किया जाता है। निलंबन सजातीय होना चाहिए और प्रति 1 मिलीलीटर में 3 बिलियन माइक्रोबियल कोशिकाएं होनी चाहिए। मारे गए रोगाणुओं के निलंबन का उपयोग - डायग्नोस्टिकम - काम को सुविधाजनक बनाता है (उत्पादन में तैयार)।

2. एंटीबॉडी (एग्लूटीनिन) रोगी के सीरम (सेरोडायग्नोसिस के दौरान) या एग्लूटीनेटिंग सीरम (सीरोटाइपिंग के दौरान) में पाए जाते हैं। एग्लूटिनेटिंग सीरा खरगोशों को मारे गए जीवाणुओं से प्रतिरक्षित करके प्राप्त किया जाता है।

एग्लूटिनेटिंग टिटरसीरम को इसका उच्चतम तनुकरण कहा जाता है, जिसमें यह कुछ प्रायोगिक स्थितियों के तहत संबंधित एंटीजन के साथ प्रतिक्रिया करता है।

एग्लूटीनेटिंग सीरा देशी (गैर-अवशोषित) और अधिशोषित हो सकता है। छोटे तनुकरण में देशी सीरा न केवल उन सूक्ष्मजीवों के प्रकार के साथ परस्पर क्रिया करता है जिनके साथ पशु को सीरम प्राप्त करने के लिए प्रतिरक्षित किया गया था, बल्कि संबंधित प्रकार के सूक्ष्मजीवों के साथ भी, क्योंकि उनमें समूह एंटीबॉडी (सूक्ष्मजीवों के लिए एंटीबॉडी जिनमें सामान्य एंटीजन होते हैं) होते हैं। देशी सीरा का उपयोग विस्तृत एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया (सेरोडायग्नोसिस के लिए) के लिए किया जाता है, जो न केवल प्रतिक्रिया की उपस्थिति को ध्यान में रखता है, बल्कि एंटीबॉडी टिटर में वृद्धि की गतिशीलता को भी ध्यान में रखता है।

यदि समूह एंटीजन वाले संबंधित बैक्टीरिया के साथ बातचीत करके समूह एंटीबॉडी को मूल सीरम से निकाला जाता है (सोख लिया जाता है), तो सोख लिया गया सीरा प्राप्त होता है। अधिशोषित सीरा मोनोरिसेप्टर (या प्रकार-विशिष्ट) हो सकता है, जिसमें केवल एक एंटीजन रिसेप्टर के प्रति एंटीबॉडी होते हैं, पॉलीवलेंट सीरा कई अधिशोषित या गैर-अवशोषित सीरा के मिश्रण से बना होता है। ग्लास एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया के लिए अधिशोषित सीरा का उपयोग किया जाता है।

जब जानवरों को एच-एंटीजन के साथ गतिशील बैक्टीरिया से प्रतिरक्षित किया जाता है, तो एच-एग्लूटीनेटिंग सीरा जिसमें एच-एंटीबॉडी होते हैं, प्राप्त होते हैं (उदाहरण के लिए, साल्मोनेला मोनोरिसेप्टर एच-एग्लूटीनेटिंग सीरम)। ओ-एंटीजन के साथ टीकाकरण से, ओ-एंटीबॉडी युक्त ओ-एग्लूटीनेटिंग सीरा प्राप्त किया जाता है (उदाहरण के लिए, साल्मोनेला समूह अधिशोषित ओ-एग्लूटीनेटिंग सीरम, एंटीकोलेरा ओ-एग्लूटीनेटिंग सीरम)। एच- और ओ-एंटीजन के साथ टीकाकरण से, एच- और ओ-एंटीजन के साथ सीरा प्राप्त होता है।

इसके अलावा, ओ-एग्लूटीनिन एक महीन दाने वाला एग्लूटीनेट उत्पन्न करता है, और एच-एग्लूटीनिन एक मोटे दाने वाली तलछट का उत्पादन करता है।

3. इलेक्ट्रोलाइट - आइसोटोनिक NaCl समाधान (आसुत जल में तैयार 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान)।

एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया करने की दो मुख्य विधियाँ हैं: कांच पर एक प्रतिक्रिया (कभी-कभी संकेतक या प्लेट प्रतिक्रिया भी कहा जाता है) और एक विस्तृत प्रतिक्रिया (टेस्ट ट्यूब में)

कांच पर एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया स्थापित करना। वसा रहित ग्लास स्लाइड पर सीरम की दो बूंदें और आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद लगाई जाती है। डायग्नोस्टिक एग्लूटीनेटिंग सीरम को एक तनुकरण में लिया जाता है, जो इसके अनुमापांक के आधार पर 1:10, 1:25, 1:50 या 1:100 होता है। अध्ययन के तहत सूक्ष्मजीव की संस्कृति को एक लूप का उपयोग करके सीरम की एक बूंद और आइसोटोनिक समाधान की एक बूंद में जोड़ा जाता है और अच्छी तरह मिलाया जाता है। सूक्ष्मजीवों के साथ सोडियम क्लोराइड की एक बूंद एंटीजन नियंत्रण है, सूक्ष्मजीवों के बिना सीरम की एक बूंद सीरम नियंत्रण है। आप कल्चर को सीरम वाली एक बूंद से NaCl वाली एक बूंद में स्थानांतरित नहीं कर सकते। प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 1-3 मिनट तक होती है। यदि सीरम नियंत्रण स्पष्ट रहता है, एंटीजन नियंत्रण में एक समान मैलापन देखा जाता है, और एग्लूटीनेट फ्लेक्स उस बूंद में दिखाई देते हैं जहां संस्कृति सीरम के साथ मिश्रित होती है, तो परिणाम सकारात्मक माना जाता है। यदि सीरम और एंटीजन के साथ बूंद में एक समान मैलापन है, तो यह एक नकारात्मक परिणाम है। गहरे रंग की पृष्ठभूमि पर प्रतिक्रिया अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई देती है।

सीरम

1. प्रतिजन नियंत्रण

2. सीरम नियंत्रण

एग्लूटिनेशन एक इलेक्ट्रोलाइट (आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान) की उपस्थिति में एंटीबॉडी के प्रभाव में रोगाणुओं या अन्य कोशिकाओं का चिपकना और अवक्षेपण है।चिपके जीवाणुओं (कोशिकाओं) के समूह को एग्लूटीनेट कहा जाता है। एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता होती है:

1. एंटीबॉडीज (एग्लूटीनिन) जो किसी बीमार या प्रतिरक्षा जानवर के सीरम में पाए जाते हैं।

2. एंटीजन - जीवित या मारे गए रोगाणुओं, लाल रक्त कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं का निलंबन।

3. आइसोटोनिक (0.9%) सोडियम क्लोराइड घोल।

सेरोडायग्नोसिस के लिए एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया का उपयोग टाइफाइड बुखार और पैराटाइफाइड बुखार (विडाल प्रतिक्रिया), ब्रुसेलोसिस (राइट और हेडलसन प्रतिक्रिया), टुलारेमिया, आदि के लिए किया जाता है। एंटीबॉडी रोगी का सीरम है, और एंटीजन एक ज्ञात सूक्ष्म जीव है। रोगाणुओं या अन्य कोशिकाओं की पहचान करते समय, उनके निलंबन का उपयोग एंटीजन के रूप में किया जाता है, और एक ज्ञात प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग एंटीबॉडी के रूप में किया जाता है। इस प्रतिक्रिया का उपयोग व्यापक रूप से आंतों के संक्रमण, काली खांसी आदि के निदान के लिए किया जाता है।

आरए के मंचन के लिए तरीके

कांच पर अनुमानित आरए

तैनात आरए

(वॉल्यूम विधि)

जमाव प्रतिक्रिया

कांच पर खुला आरए (सीरोपहचान)

कांच पर एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया।विशिष्ट (सोखने योग्य) सीरम की दो बूंदें और आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद वसा रहित ग्लास स्लाइड पर लगाई जाती है। गैर-अवशोषित सीरम को 1:5 - 1:100 के अनुपात में पहले से पतला किया जाता है। बूंदों को गिलास पर लगाना चाहिए ताकि उनके बीच दूरी बनी रहे। कल्चर को एक लूप या पिपेट के साथ कांच पर अच्छी तरह से पीस लिया जाता है, और फिर आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद और सीरम की बूंदों में से एक में मिलाया जाता है, प्रत्येक में तब तक हिलाया जाता है जब तक कि एक सजातीय निलंबन नहीं बन जाता। बिना कल्चर के सीरम की एक बूंद सीरम नियंत्रण है।

ध्यान!आप कल्चर को सीरम से आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद में स्थानांतरित नहीं कर सकते हैं, जो एंटीजन नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 1-3 मिनट तक होती है। यदि सीरम नियंत्रण पारदर्शी रहता है, तो एंटीजन नियंत्रण में एक समान मैलापन देखा जाता है, और एग्लूटीनेट फ्लेक्स उस बूंद में दिखाई देते हैं जहां संस्कृति को एक स्पष्ट तरल की पृष्ठभूमि के खिलाफ सीरम के साथ मिलाया जाता है, प्रतिक्रिया परिणाम सकारात्मक माना जाता है।

डायग्नोस्टिक फिजियोलॉजिकल

सीरम + कल्चर सॉल्यूशन + कल्चर

विस्तृत एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया (वॉल्यूम विधि)।सीरियल, अक्सर दो गुना, सीरम का पतलापन तैयार किया जाता है। विधि को वॉल्यूमेट्रिक कहा जाता है। रक्त सीरम में एंटीबॉडी टिटर निर्धारित करने के लिए, 6 ट्यूब लें। पहली परखनली में मूल सीरम तनुकरण 1:50 का 1 मिलीलीटर डालें और एक स्नातक पिपेट का उपयोग करके सभी 6 परखनलियों में 1 मिलीलीटर खारा घोल डालें। पहली टेस्ट ट्यूब 2 मिलीलीटर की मात्रा के साथ 1:100 का सीरम तनुकरण प्राप्त करेगी। पहली टेस्ट ट्यूब से 1 मिलीलीटर को दूसरी टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें, जहां तनुकरण 1:200 हो जाता है। तो पहले 5 टेस्ट ट्यूब (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600) में सीरम के क्रमिक तनुकरण की एक श्रृंखला बनाएं। पांचवीं परखनली से 1 मिलीलीटर कीटाणुनाशक घोल में डालें। सभी 6 टेस्ट ट्यूबों में डायग्नोस्टिकम की 2 बूंदें मिलाएं। छठी ट्यूब एक कल्चर नियंत्रण है, क्योंकि इसमें केवल खारा समाधान और डायग्नोस्टिकम होता है।

संस्कृति के सहज समूहन को बाहर करने के लिए ऐसा नियंत्रण आवश्यक है। ट्यूबों को हिलाया जाता है और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर थर्मोस्टेट में रखा जाता है, और फिर कमरे के तापमान पर एक दिन के लिए छोड़ दिया जाता है, जिसके बाद एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया के परिणाम दर्ज किए जाते हैं। जीवन के पहले महीनों में बच्चों के सीरा के साथ एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया करते समय, एंटीबॉडी गठन की कार्यात्मक हीनता के कारण, कम एंटीबॉडी टाइटर्स की पहचान करना आवश्यक होता है, जिसे सीरम को पतला करते समय ध्यान में रखा जाता है। प्रारंभिक सीरम तनुकरण 1:25 है। पहली परखनली में 1:50 का तनुकरण प्राप्त होता है, फिर 1:100 आदि।

यदि प्रतिक्रिया का परिणाम सकारात्मक है, तो परीक्षण ट्यूब एक स्पष्ट तरल की पृष्ठभूमि के खिलाफ अनाज या गुच्छे के रूप में फंसी हुई कोशिकाओं को दिखाती हैं।एग्लूटीनेट धीरे-धीरे "छाता" के रूप में नीचे बैठ जाता है, और तलछट के ऊपर का तरल साफ हो जाता है। एंटीजन नियंत्रण समान रूप से अशांत है।

तलछट की प्रकृति के आधार पर, बारीक और मोटे दाने वाले (परतदार) एग्लूटीनेशन को प्रतिष्ठित किया जाता है। ओ-सेरा के साथ काम करने पर बारीक दाने वाला एग्लूटिनेशन प्राप्त होता है। मोटे दाने वाले - जब गतिशील रोगाणु फ्लैगेलर एच-सेरा के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। यह बारीक कणों की तुलना में तेजी से होता है, और परिणामी तलछट बहुत ढीली होती है और आसानी से टूट जाती है।

प्रतिक्रिया की तीव्रता इस प्रकार व्यक्त की गई है:

सभी कोशिकाएँ व्यवस्थित हो गई हैं, परखनली में तरल पूरी तरह से पारदर्शी है। प्रतिक्रिया का परिणाम अत्यंत सकारात्मक है;

तलछट कम होती है, तरल पूरी तरह साफ़ नहीं होता है। प्रतिक्रिया का परिणाम सकारात्मक है;

तलछट और भी कम है, तरल बादलयुक्त है। प्रतिक्रिया का परिणाम संदिग्ध है;

परखनली के तल पर हल्की सी तलछट है, तरल बादलयुक्त है। संदिग्ध प्रतिक्रिया परिणाम;

कोई तलछट नहीं है, तरल समान रूप से धुंधला है, जैसा कि एंटीजन नियंत्रण में होता है। नकारात्मक प्रतिक्रिया परिणाम

एग्लूटिनेशन एक इलेक्ट्रोलाइट (आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान) की उपस्थिति में एंटीबॉडी के प्रभाव में रोगाणुओं या अन्य कोशिकाओं का चिपकना और अवक्षेपण है।चिपके जीवाणुओं (कोशिकाओं) के समूह को एग्लूटीनेट कहा जाता है। एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता होती है:

1. एंटीबॉडीज (एग्लूटीनिन) जो किसी बीमार या प्रतिरक्षा जानवर के सीरम में पाए जाते हैं।

2. एंटीजन - जीवित या मारे गए रोगाणुओं, लाल रक्त कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं का निलंबन।

3. आइसोटोनिक (0.9%) सोडियम क्लोराइड घोल।

सेरोडायग्नोसिस के लिए एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया का उपयोग टाइफाइड बुखार और पैराटाइफाइड बुखार (विडाल प्रतिक्रिया), ब्रुसेलोसिस (राइट और हेडलसन प्रतिक्रिया), टुलारेमिया, आदि के लिए किया जाता है। एंटीबॉडी रोगी का सीरम है, और एंटीजन एक ज्ञात सूक्ष्म जीव है। रोगाणुओं या अन्य कोशिकाओं की पहचान करते समय, उनके निलंबन का उपयोग एंटीजन के रूप में किया जाता है, और एक ज्ञात प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग एंटीबॉडी के रूप में किया जाता है। इस प्रतिक्रिया का उपयोग व्यापक रूप से आंतों के संक्रमण, काली खांसी आदि के निदान के लिए किया जाता है।

आरए के मंचन के लिए तरीके

कांच पर अनुमानित आरए

तैनात आरए

(वॉल्यूम विधि)

जमाव प्रतिक्रिया

कांच पर खुला आरए (सीरोपहचान)

कांच पर एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया।विशिष्ट (सोखने योग्य) सीरम की दो बूंदें और आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद वसा रहित ग्लास स्लाइड पर लगाई जाती है। गैर-अवशोषित सीरम को 1:5 - 1:100 के अनुपात में पहले से पतला किया जाता है। बूंदों को गिलास पर लगाना चाहिए ताकि उनके बीच दूरी बनी रहे। कल्चर को एक लूप या पिपेट के साथ कांच पर अच्छी तरह से पीसा जाता है, और फिर आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद और सीरम की बूंदों में से एक में मिलाया जाता है, जब तक कि एक सजातीय निलंबन नहीं बन जाता है, तब तक प्रत्येक में हिलाते रहें। बिना कल्चर के सीरम की एक बूंद सीरम नियंत्रण है।

ध्यान!आप कल्चर को सीरम से आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद में स्थानांतरित नहीं कर सकते हैं, जो एंटीजन नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 1-3 मिनट तक होती है। यदि सीरम नियंत्रण पारदर्शी रहता है, तो एंटीजन नियंत्रण में एक समान मैलापन देखा जाता है, और एग्लूटीनेट फ्लेक्स उस बूंद में दिखाई देते हैं जहां संस्कृति को एक स्पष्ट तरल की पृष्ठभूमि के खिलाफ सीरम के साथ मिलाया जाता है, प्रतिक्रिया परिणाम सकारात्मक माना जाता है।

डायग्नोस्टिक फिजियोलॉजिकल

सीरम + कल्चर सॉल्यूशन + कल्चर

विस्तृत एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया (वॉल्यूम विधि)।सीरियल, अक्सर दो गुना, सीरम का पतलापन तैयार किया जाता है। विधि को वॉल्यूमेट्रिक कहा जाता है। रक्त सीरम में एंटीबॉडी टिटर निर्धारित करने के लिए, 6 ट्यूब लें। पहली परखनली में मूल सीरम तनुकरण 1:50 का 1 मिलीलीटर डालें और एक स्नातक पिपेट का उपयोग करके सभी 6 परखनलियों में 1 मिलीलीटर खारा घोल डालें। पहली टेस्ट ट्यूब 2 मिलीलीटर की मात्रा के साथ 1:100 का सीरम तनुकरण प्राप्त करेगी। पहली टेस्ट ट्यूब से 1 मिलीलीटर को दूसरी टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें, जहां तनुकरण 1:200 हो जाता है। तो पहले 5 टेस्ट ट्यूब (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600) में सीरम के क्रमिक तनुकरण की एक श्रृंखला बनाएं। पांचवीं परखनली से 1 मिलीलीटर कीटाणुनाशक घोल में डालें। सभी 6 टेस्ट ट्यूबों में डायग्नोस्टिकम की 2 बूंदें मिलाएं। छठी ट्यूब एक कल्चर नियंत्रण है, क्योंकि इसमें केवल खारा समाधान और डायग्नोस्टिकम होता है।

संस्कृति के सहज समूहन को बाहर करने के लिए ऐसा नियंत्रण आवश्यक है। ट्यूबों को हिलाया जाता है और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर थर्मोस्टेट में रखा जाता है, और फिर कमरे के तापमान पर एक दिन के लिए छोड़ दिया जाता है, जिसके बाद एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया के परिणाम दर्ज किए जाते हैं। जीवन के पहले महीनों में बच्चों के सीरा के साथ एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया करते समय, एंटीबॉडी गठन की कार्यात्मक हीनता के कारण, कम एंटीबॉडी टाइटर्स की पहचान करना आवश्यक होता है, जिसे सीरम को पतला करते समय ध्यान में रखा जाता है। प्रारंभिक सीरम तनुकरण 1:25 है। पहली परखनली में 1:50 का तनुकरण प्राप्त होता है, फिर 1:100 आदि।

यदि प्रतिक्रिया का परिणाम सकारात्मक है, तो परीक्षण ट्यूब एक स्पष्ट तरल की पृष्ठभूमि के खिलाफ अनाज या गुच्छे के रूप में फंसी हुई कोशिकाओं को दिखाती हैं।एग्लूटीनेट धीरे-धीरे "छाता" के रूप में नीचे बैठ जाता है, और तलछट के ऊपर का तरल साफ हो जाता है। एंटीजन नियंत्रण समान रूप से अशांत है।

तलछट की प्रकृति के आधार पर, बारीक और मोटे दाने वाले (परतदार) एग्लूटीनेशन को प्रतिष्ठित किया जाता है। ओ-सेरा के साथ काम करने पर बारीक दाने वाला एग्लूटिनेशन प्राप्त होता है। मोटे दाने वाले - जब गतिशील रोगाणु फ्लैगेलर एच-सेरा के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। यह बारीक कणों की तुलना में तेजी से होता है, और परिणामी तलछट बहुत ढीली होती है और आसानी से टूट जाती है।

प्रतिक्रिया की तीव्रता इस प्रकार व्यक्त की गई है:

सभी कोशिकाएँ व्यवस्थित हो गई हैं, परखनली में तरल पूरी तरह से पारदर्शी है। प्रतिक्रिया का परिणाम अत्यंत सकारात्मक है;

तलछट कम होती है, तरल पूरी तरह साफ़ नहीं होता है। प्रतिक्रिया का परिणाम सकारात्मक है;

तलछट और भी कम है, तरल बादलयुक्त है। प्रतिक्रिया का परिणाम संदिग्ध है;

परखनली के तल पर हल्की सी तलछट है, तरल बादलयुक्त है। संदिग्ध प्रतिक्रिया परिणाम;

कोई तलछट नहीं है, तरल समान रूप से धुंधला है, जैसा कि एंटीजन नियंत्रण में होता है। नकारात्मक प्रतिक्रिया परिणाम

1.1. समूहन प्रतिक्रिया (आरए)

समूहन प्रतिक्रिया (आरए)

अपनी विशिष्टता, प्रदर्शन में आसानी और प्रदर्शनात्मकता के कारण, कई संक्रामक रोगों के निदान के लिए सूक्ष्मजीवविज्ञानी अभ्यास में एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया व्यापक हो गई है।

एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया संपूर्ण माइक्रोबियल या अन्य कोशिकाओं (एग्लूटीनोजेन) के साथ एंटीबॉडी (एग्लूटीनिन) की बातचीत की विशिष्टता पर आधारित है। इस अंतःक्रिया के परिणामस्वरूप, कण और समूह बनते हैं, जो गुच्छे के रूप में अवक्षेपित (एग्लूटीनेट) होते हैं।

एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया में जीवित और मारे गए बैक्टीरिया, स्पाइरोकेट्स, कवक, प्रोटोजोआ, रिकेट्सिया, साथ ही लाल रक्त कोशिकाएं और अन्य कोशिकाएं शामिल हो सकती हैं। प्रतिक्रिया दो चरणों में होती है: पहला (अदृश्य) विशिष्ट, एंटीजन और एंटीबॉडी का संयोजन, दूसरा (दृश्यमान) गैर-विशिष्ट, एंटीजन का चिपकना, यानी। एग्लूटिनेट गठन.

एक एग्लूटीनेट तब बनता है जब एक द्विसंयोजक एंटीबॉडी का एक सक्रिय केंद्र एक एंटीजन के निर्धारक समूह के साथ जुड़ता है। एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया, किसी भी सीरोलॉजिकल प्रतिक्रिया की तरह, इलेक्ट्रोलाइट्स की उपस्थिति में होती है।

बाह्य रूप से, एक सकारात्मक एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया की अभिव्यक्ति का दोहरा चरित्र होता है। फ़्लैगेलेटेड रोगाणुओं में जिनमें केवल दैहिक O2 एंटीजन होता है, माइक्रोबियल कोशिकाएं स्वयं सीधे एक साथ चिपक जाती हैं। इस एग्लूटीनेशन को बारीक कण कहा जाता है। यह 18 22 घंटों के भीतर होता है। वी

फ्लैगेलेट रोगाणुओं में दो एंटीजन होते हैं: दैहिक O2 एंटीजन और फ्लैगेलर H2 एंटीजन। यदि कोशिकाओं को फ्लैगेल्ला द्वारा एक साथ चिपका दिया जाता है, तो बड़े, ढीले गुच्छे बनते हैं और इस एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया को मोटे दाने वाला कहा जाता है। यह 2 4 घंटे के भीतर होता है.

एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया रोगी के रक्त सीरम में विशिष्ट एंटीबॉडी के गुणात्मक और मात्रात्मक निर्धारण और पृथक रोगज़नक़ की प्रजातियों का निर्धारण करने के उद्देश्य से की जा सकती है। वी

एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया को एक विस्तारित संस्करण में किया जा सकता है, जो आपको डायग्नोस्टिक टिटर में पतला सीरम के साथ काम करने की अनुमति देता है, और एक संकेतक प्रतिक्रिया के संस्करण में, जो सिद्धांत रूप में, विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने या प्रजातियों का निर्धारण करने की अनुमति देता है। रोगज़नक़।

विस्तृत एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया करते समय, विषय के रक्त सीरम में विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए, परीक्षण सीरम को 1:50 या 1:100 के कमजोर पड़ने पर लिया जाता है। यह इस तथ्य के कारण है कि सामान्य एंटीबॉडी पूरे या थोड़े पतले सीरम में बहुत अधिक सांद्रता में मौजूद हो सकते हैं, और फिर प्रतिक्रिया के परिणाम गलत हो सकते हैं। प्रतिक्रिया के इस संस्करण में जिस सामग्री का परीक्षण किया जा रहा है वह रोगी का रक्त है।

रक्त खाली पेट या भोजन के 6 घंटे से पहले नहीं लिया जाता है (अन्यथा रक्त सीरम में वसा की बूंदें हो सकती हैं, जिससे यह धुंधला हो जाता है और अनुसंधान के लिए अनुपयुक्त हो जाता है)। रोगी का रक्त सीरम आमतौर पर रोग के दूसरे सप्ताह में प्राप्त किया जाता है, जिसमें क्यूबिटल नस से 3 × 4 मिलीलीटर रक्त बाँझ रूप से एकत्र किया जाता है (इस समय तक विशिष्ट एंटीबॉडी की अधिकतम मात्रा केंद्रित होती है)। एक विशिष्ट एंटीजेनिक संरचना वाली एक विशिष्ट प्रजाति की मृत लेकिन नष्ट नहीं हुई माइक्रोबियल कोशिकाओं से तैयार डायग्नोस्टिकम का उपयोग ज्ञात एंटीजन के रूप में किया जाता है।

रोगज़नक़ की प्रजाति और प्रकार को निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया करते समय, एंटीजन अध्ययन की जा रही सामग्री से पृथक एक जीवित रोगज़नक़ होता है। प्रतिरक्षा निदान सीरम में निहित एंटीबॉडी ज्ञात हैं। वी

टीकाकरण किए गए खरगोश के रक्त से प्रतिरक्षा निदान सीरम प्राप्त किया जाता है। टिटर (अधिकतम तनुकरण जिस पर एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है) निर्धारित करने के बाद, डायग्नोस्टिक सीरम को एक परिरक्षक के साथ ampoules में डाला जाता है। इस सीरम का उपयोग पृथक रोगज़नक़ की एंटीजेनिक संरचना द्वारा पहचान के लिए किया जाता है।

एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया के विकल्प

इन प्रतिक्रियाओं में कणों के रूप में एंटीजन (माइक्रोबियल कोशिकाएं, लाल रक्त कोशिकाएं और अन्य कणिका एंटीजन) शामिल होते हैं, जो एंटीबॉडी द्वारा एक साथ चिपक जाते हैं और अवक्षेपित हो जाते हैं।

एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया (आरए) करने के लिए, तीन घटकों की आवश्यकता होती है: 1) एंटीजन (एग्लूटीनोजेन); 2) एंटीबॉडी (एग्लूटीनिन) और 3) इलेक्ट्रोलाइट (आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान)।

ओरिएंटेटिव (प्लेट) एग्लूटिनेशन रिएक्शन (आरए)

एक संकेतक, या प्लेट, आरए को कमरे के तापमान पर एक ग्लास स्लाइड पर रखा जाता है। ऐसा करने के लिए, ग्लास पर 1:10 1:20 के तनुकरण पर सीरम की एक बूंद और आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की एक नियंत्रण बूंद को अलग से लगाने के लिए पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। कालोनियों या बैक्टीरिया की दैनिक संस्कृति (डायग्नोस्टिकम की एक बूंद) को दोनों बैक्टीरियोलॉजिकल लूप में पेश किया जाता है और अच्छी तरह मिलाया जाता है। प्रतिक्रियाओं को कुछ मिनटों के बाद दृष्टिगत रूप से ध्यान में रखा जाता है, कभी-कभी एक आवर्धक लेंस (x5) का उपयोग करके। सकारात्मक आरए के साथ, सीरम की एक बूंद में बड़े और छोटे गुच्छे की उपस्थिति नोट की जाती है, नकारात्मक के साथ, सीरम समान रूप से धुंधला रहता है।

अप्रत्यक्ष (निष्क्रिय) रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (आरएनजीए, आरपीजीए)

प्रतिक्रिया इस प्रकार की जाती है: 1) पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन, बैक्टीरिया के अर्क और अन्य अत्यधिक फैले हुए पदार्थों, रिकेट्सिया और वायरस का पता लगाने के लिए, जिनमें से एग्लूटीनिन के साथ कॉम्प्लेक्स को पारंपरिक आरए में नहीं देखा जा सकता है, या 2) रोगियों के सीरा में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए ये अत्यधिक बिखरे हुए पदार्थ और सबसे छोटे सूक्ष्मजीव हैं।

अप्रत्यक्ष, या निष्क्रिय, एग्लूटिनेशन को एक प्रतिक्रिया के रूप में समझा जाता है जिसमें एंटीबॉडी निष्क्रिय कणों (लेटेक्स, सेलूलोज़, पॉलीस्टीरिन, बेरियम ऑक्साइड इत्यादि या भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं, मानव रक्त समूह I (0)) पर पूर्व-अवशोषित एंटीजन के साथ बातचीत करते हैं।

निष्क्रिय हेमग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया (आरपीएचए) में, लाल रक्त कोशिकाओं को वाहक के रूप में उपयोग किया जाता है। एंटीजन से भरी लाल रक्त कोशिकाएं इस एंटीजन के प्रति विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति में एक साथ चिपक जाती हैं और अवक्षेपित हो जाती हैं। एंटीजन-सेंसिटाइज़्ड एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग आरपीजीए में एंटीबॉडी (सेरोडायग्नोसिस) का पता लगाने के लिए एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम के रूप में किया जाता है। यदि लाल रक्त कोशिकाएं एंटीबॉडी (एरिथ्रोसाइट एंटीबॉडी डायग्नोस्टिकम) से भरी हुई हैं, तो इसका उपयोग एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

मंचन. पॉलीस्टायरीन प्लेटों के कुओं में सीरम के क्रमिक तनुकरण की एक श्रृंखला तैयार की जाती है। अंतिम कुएं में 0.5 मिलीलीटर स्पष्ट रूप से सकारात्मक सीरम और अंतिम कुएं में 0.5 मिलीलीटर शारीरिक समाधान (नियंत्रण) जोड़ें। फिर सभी कुओं में 0.1 मिलीलीटर पतला एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम डालें, हिलाएं और 2 घंटे के लिए थर्मोस्टेट में रखें

लेखांकन। एक सकारात्मक मामले में, लाल रक्त कोशिकाएं एक मुड़े हुए या दांतेदार किनारे (उल्टे छाते) के साथ कोशिकाओं की एक समान परत के रूप में छेद के नीचे बस जाती हैं; एक नकारात्मक मामले में, वे एक बटन या अंगूठी के रूप में बस जाती हैं; .

1.2. निराकरण प्रतिक्रिया। लिसिस,
ऑप्सोनोफैगोसिटिक प्रतिक्रिया, अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया

एंटीटॉक्सिन (आरएन) के साथ एक्सोटॉक्सिन के निष्प्रभावीकरण की प्रतिक्रिया

प्रतिक्रिया एक्सोटॉक्सिन के प्रभाव को बेअसर करने के लिए एंटीटॉक्सिक सीरम की क्षमता पर आधारित है। इसका उपयोग एंटीटॉक्सिक सीरम के अनुमापन और एक्सोटॉक्सिन के निर्धारण के लिए किया जाता है।

सीरम का अनुमापन करते समय, संबंधित विष की एक निश्चित खुराक को एंटीटॉक्सिक सीरम के विभिन्न तनुकरणों में जोड़ा जाता है। जब एंटीजन पूरी तरह से निष्प्रभावी हो जाता है और कोई अप्रयुक्त एंटीबॉडी नहीं रहती है, तो प्रारंभिक फ़्लोक्यूलेशन होता है। फ्लोक्यूलेशन प्रतिक्रिया का उपयोग न केवल सीरम के अनुमापन (उदाहरण के लिए, डिप्थीरिया) के लिए किया जा सकता है, बल्कि विष और टॉक्सोइड के अनुमापन के लिए भी किया जा सकता है। एंटीटॉक्सिक चिकित्सीय सीरम की गतिविधि को निर्धारित करने की एक विधि के रूप में एंटीटॉक्सिन के साथ विष को बेअसर करने की प्रतिक्रिया का बहुत व्यावहारिक महत्व है। इस प्रतिक्रिया में एंटीजन एक सच्चा एक्सोटॉक्सिन है।

एंटीटॉक्सिक सीरम की ताकत एई की पारंपरिक इकाइयों द्वारा निर्धारित की जाती है।

बोटुलिनम सीरम का 1 एई इसकी मात्रा बोटुलिनम विष के 1000 डीएलएम को निष्क्रिय कर देती है। एक्सोटॉक्सिन की प्रजाति या प्रकार (टेटनस, बोटुलिज़्म, डिप्थीरिया, आदि के निदान के लिए) को निर्धारित करने के लिए तटस्थीकरण प्रतिक्रिया इन विट्रो (रेमन के अनुसार) में की जा सकती है, और माइक्रोबियल कोशिकाओं की विषाक्तता का निर्धारण करते समय - एक जेल में ( ऑचटरलोनी के अनुसार)।

लाइसिस प्रतिक्रिया (आरएल)

प्रतिरक्षा सीरम के सुरक्षात्मक गुणों में से एक शरीर में प्रवेश करने वाले रोगाणुओं या सेलुलर तत्वों को भंग करने की क्षमता है।

विशिष्ट एंटीबॉडी जो कोशिका विघटन (लिसिस) का कारण बनते हैं, लाइसिन कहलाते हैं। एंटीजन की प्रकृति के आधार पर, वे बैक्टीरियोलिसिन, साइटोलिसिन, स्पाइरोचेटोलिसिन, हेमोलिसिन आदि हो सकते हैं।

लाइसिन केवल अतिरिक्त पूरक कारक की उपस्थिति में ही अपना प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। पूरक, गैर-विशिष्ट ह्यूमरल प्रतिरक्षा के एक कारक के रूप में, मस्तिष्कमेरु द्रव और आंख के पूर्वकाल कक्ष के तरल पदार्थ को छोड़कर, लगभग सभी शरीर के तरल पदार्थों में पाया जाता है। मानव रक्त सीरम में पूरक की काफी उच्च और निरंतर सामग्री देखी जाती है और गिनी सूअरों के रक्त सीरम में इसकी बहुत अधिक मात्रा देखी जाती है। अन्य स्तनधारियों में, रक्त सीरम में पूरक की सामग्री भिन्न होती है।

पूरक सीरम प्रोटीन की एक जटिल प्रणाली है। यह अस्थिर है और 30 मिनट के लिए 55 डिग्री पर ढह जाता है। कमरे के तापमान पर, पूरक दो घंटे के भीतर नष्ट हो जाता है। लंबे समय तक झटकों, एसिड और पराबैंगनी किरणों के प्रति बहुत संवेदनशील। हालाँकि, पूरक को कम तापमान पर सूखी अवस्था में लंबे समय तक (छह महीने तक) संग्रहीत किया जाता है। पूरक माइक्रोबियल कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं के लसीका को बढ़ावा देता है।

बैक्टीरियोलिसिस और हेमोलिसिस की प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर किया जाता है।

बैक्टीरियोलिसिस प्रतिक्रिया का सार यह है कि जब एक विशिष्ट प्रतिरक्षा सीरम पूरक की उपस्थिति में अपने संबंधित समजात जीवित माइक्रोबियल कोशिकाओं के साथ जुड़ता है, तो माइक्रोबियल लिसीस होता है।

हेमोलिसिस प्रतिक्रिया यह है कि जब एरिथ्रोसाइट्स एक विशिष्ट सीरम के संपर्क में आते हैं जो पूरक की उपस्थिति में उनके प्रति प्रतिरोधी (हेमोलिटिक) होता है, तो एरिथ्रोसाइट्स का विघटन देखा जाता है, यानी। हेमोलिसिस।

प्रयोगशाला अभ्यास में हेमोलिसिस प्रतिक्रिया का उपयोग पूरक सीमा निर्धारित करने के साथ-साथ नैदानिक ​​पूरक निर्धारण प्रतिक्रियाओं के परिणामों को ध्यान में रखने के लिए किया जाता है। पूरक टिटर इसकी सबसे छोटी मात्रा है, जो 2.5 मिलीलीटर की मात्रा में हेमोलिटिक प्रणाली में 30 मिनट के भीतर लाल रक्त कोशिकाओं के विश्लेषण का कारण बनता है। सभी सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की तरह, लसीका प्रतिक्रिया, इलेक्ट्रोलाइट की उपस्थिति में होती है।

अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाएं (एलर्जी)

एंटीजन के कुछ रूप, शरीर के साथ बार-बार संपर्क करने पर, एक ऐसी प्रतिक्रिया का कारण बन सकते हैं जो अपने आधार पर विशिष्ट होती है, लेकिन इसमें तीव्र सूजन प्रतिक्रिया के गैर-विशिष्ट सेलुलर और आणविक कारक शामिल होते हैं। अतिसंवेदनशीलता के दो ज्ञात रूप हैं: तत्काल-प्रकार की अतिसंवेदनशीलता (IHT) और विलंबित-प्रकार की अतिसंवेदनशीलता (DTH)। पहले प्रकार की प्रतिक्रिया एंटीबॉडी की भागीदारी के साथ होती है, और प्रतिक्रिया एलर्जेन के साथ बार-बार संपर्क के 2 घंटे बाद विकसित नहीं होती है। दूसरे प्रकार को प्रतिक्रिया के मुख्य प्रभावक के रूप में सूजन टी कोशिकाओं (टीजीसी) की मदद से महसूस किया जाता है, जिससे सूजन के क्षेत्र में मैक्रोफेज का संचय सुनिश्चित होता है, प्रतिक्रिया 6-8 घंटों के बाद और बाद में प्रकट होती है;

अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया का विकास एक एंटीजन के साथ मुठभेड़ और संवेदीकरण की घटना से पहले होता है, यानी। एंटीबॉडी की उपस्थिति, सक्रिय रूप से संवेदनशील लिम्फोसाइट्स और अन्य ल्यूकोसाइट्स (मैक्रोफेज, ग्रैन्यूलोसाइट्स) के निष्क्रिय रूप से संवेदनशील साइटोफिलिक एंटीबॉडी।

अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं के विकास के तीन चरण होते हैं: प्रतिरक्षाविज्ञानी; पैथोकेमिकल; पैथोफिजियोलॉजिकल.

पहले, विशिष्ट चरण में, एलर्जेन एंटीबॉडी और (या) संवेदनशील कोशिकाओं के साथ संपर्क करता है। दूसरे चरण में, सक्रिय कोशिकाओं से जैविक रूप से सक्रिय पदार्थ निकलते हैं। जारी किए गए मध्यस्थ (हिस्टामाइन, सेरोटोनिन, ल्यूकोट्रिएन, ब्रैडीकाइनिन, आदि) संबंधित प्रकार की प्रतिक्रिया के तीसरे चरण की विशेषता वाले विभिन्न परिधीय प्रभावों का कारण बनते हैं।

टाइप 4 अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाएं

इस प्रकार की प्रतिक्रियाएं संवेदनशील टी हेल्पर कोशिकाओं, साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (टी किलर कोशिकाओं) और मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट प्रणाली की सक्रिय कोशिकाओं के रोगजनक अंतरकोशिकीय संपर्क के कारण होती हैं, जो बैक्टीरिया एंटीजन द्वारा प्रतिरक्षा प्रणाली की लंबे समय तक उत्तेजना के कारण होती हैं, जिसमें ए आंतरिक वातावरण से संक्रामक रोगों के जीवाणु रोगजनकों को खत्म करने के लिए शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली की सापेक्ष अपर्याप्तता। ये अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाएं तपेदिक के रोगियों में तपेदिक फेफड़ों की गुहाओं, उनके केसियस नेक्रोसिस और सामान्य नशा का कारण बनती हैं। मॉर्फोपैथोजेनेटिक शब्दों में तपेदिक और कुष्ठ रोग में त्वचीय ग्रैनुलोमैटोसिस काफी हद तक चौथे प्रकार की अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं से बना है।

चौथे प्रकार की अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया का सबसे प्रसिद्ध उदाहरण मंटौक्स प्रतिक्रिया है, जो एक ऐसे रोगी को ट्यूबरकुलिन के इंट्राडर्मल इंजेक्शन के स्थल पर विकसित होता है जिसका शरीर और सिस्टम माइकोबैक्टीरियल एंटीजन के प्रति संवेदनशील होता है। प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप, केंद्र में परिगलन के साथ एक घना हाइपरमिक पप्यूले बनता है, जो ट्यूबरकुलिन के इंट्राडर्मल इंजेक्शन के कुछ घंटों (धीरे-धीरे) ही प्रकट होता है। पप्यूले का निर्माण संवहनी बिस्तर से अंतरकोशिकीय स्थानों में परिसंचारी रक्त के मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स की रिहाई के साथ शुरू होता है। इसी समय, संवहनी बिस्तर से पॉलीमॉर्फोन्यूक्लियर कोशिकाओं का प्रवास शुरू हो जाता है। फिर न्यूट्रोफिल द्वारा घुसपैठ कम हो जाती है, और घुसपैठ में मुख्य रूप से लिम्फोसाइट्स और मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स शामिल होने लगते हैं। यह मंटौक्स प्रतिक्रिया से आर्थस प्रतिक्रिया से भिन्न है, जिसमें मुख्य रूप से पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स घाव के स्थल पर जमा होते हैं।

टाइप 4 अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं में, एंटीजन द्वारा संवेदनशील लिम्फोसाइटों की दीर्घकालिक उत्तेजना, पैथोलॉजिकल ऊतक परिवर्तनों के स्थानों में, टी हेल्पर कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन्स के पैथोलॉजिकल रूप से तीव्र और लंबे समय तक जारी होने की ओर ले जाती है। ऊतक क्षति के स्थान पर साइटोकिन्स की तीव्र रिहाई से वहां स्थित मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट सिस्टम की कोशिकाएं अतिसक्रिय हो जाती हैं, जिनमें से कई, अतिसक्रिय अवस्था में, एपिथेलिओइड कोशिकाओं के स्ट्रैंड बनाते हैं, और कुछ एक दूसरे के साथ विलय करके विशाल कोशिकाएं बनाते हैं। मैक्रोफेज, जिनकी सतह पर बैक्टीरिया और वायरल एंटीजन उजागर होते हैं, उन्हें टीकिलर्स (प्राकृतिक हत्यारों) के कामकाज के माध्यम से नष्ट किया जा सकता है।

चौथे प्रकार की अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया टी सहायक कोशिकाओं द्वारा एक विदेशी जीवाणु प्रतिजन की पहचान से प्रेरित होती है जो इसके प्रति संवेदनशील होती है। मान्यता के लिए एक आवश्यक शर्त एंडोसाइटोसिस और मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स द्वारा विदेशी इम्युनोजेन के प्रसंस्करण के बाद एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं की सतह पर उजागर एंटीजन के साथ प्रेरकों की बातचीत है। एक अन्य आवश्यक शर्त प्रमुख हिस्टोकोम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स से कक्षा I अणुओं के साथ संयोजन में एंटीजन का संपर्क है। एंटीजन पहचान के बाद, संवेदनशील सहायक कोशिकाएं साइटोकिन्स और विशेष रूप से इंटरल्यूकिन2 छोड़ती हैं, जो प्राकृतिक किलर कोशिकाओं और मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स को सक्रिय करती हैं। सक्रिय मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स प्रोटियोलिटिक एंजाइम और मुक्त ऑक्सीजन रेडिकल्स छोड़ते हैं, जो ऊतक को नुकसान पहुंचाते हैं।

त्वचा एलर्जी परीक्षण एलर्जी के प्रति शरीर की संवेदनशीलता को निर्धारित करने, इसके संक्रमण का निर्धारण करने के लिए परीक्षण हैं, उदाहरण के लिए, तपेदिक, ब्रुसेलोसिस, सामूहिक प्रतिरक्षा का स्तर, उदाहरण के लिए, टुलारेमिया। एलर्जेन प्रशासन की साइट के आधार पर, ये हैं: 1) त्वचा परीक्षण; 2) स्केरिफिकेशन; 3) इंट्राडर्मल; 4) चमड़े के नीचे। त्वचा एलर्जी परीक्षण के दौरान किसी एलर्जेन के प्रति नैदानिक ​​प्रतिक्रिया को स्थानीय, सामान्य और फोकल, साथ ही तत्काल और विलंबित में विभाजित किया जाता है।

मध्यस्थ प्रकार जीएनटी की स्थानीय प्रतिक्रियाएं 520 मिनट के बाद होती हैं, एरिथेमा और छाले के रूप में व्यक्त की जाती हैं, कुछ घंटों के बाद गायब हो जाती हैं, और एरिथेमा के आकार द्वारा प्लस विधि द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, जिसे मिमी में मापा जाता है। स्थानीय एचआरटी प्रतिक्रियाएं 24-48 घंटों के भीतर होती हैं, लंबे समय तक चलती हैं, घुसपैठ के रूप में प्रकट होती हैं, कभी-कभी केंद्र में परिगलन के साथ, और मिमी में घुसपैठ के आकार द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, साथ ही प्लस सिस्टम का उपयोग भी किया जाता है। एचएनटी के साइटोटॉक्सिक और इम्यूनोकॉम्पलेक्स प्रकार के साथ, हाइपरमिया और घुसपैठ 3-4 घंटों के बाद देखी जाती है, अधिकतम 6-8 घंटों तक पहुंचती है और लगभग एक दिन के बाद कम हो जाती है। कभी-कभी संयुक्त प्रतिक्रियाएँ देखी जाती हैं।

1.3. पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया (एफएफआर)

इस प्रतिक्रिया का उपयोग प्रयोगशाला अध्ययनों में विभिन्न संक्रमणों के लिए रक्त सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ-साथ इसकी एंटीजेनिक संरचना द्वारा रोगज़नक़ की पहचान करने के लिए किया जाता है।

पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया एक जटिल सीरोलॉजिकल प्रतिक्रिया है और अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट है।

इस प्रतिक्रिया की एक विशेषता यह है कि विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ बातचीत के दौरान एंटीजन में परिवर्तन केवल पूरक की उपस्थिति में होता है। पूरक केवल "एंटीबॉडी एंटीजन" कॉम्प्लेक्स पर अधिशोषित होता है। "एंटीबॉडी एंटीजन" कॉम्प्लेक्स तभी बनता है जब सीरम में एंटीजन और एंटीबॉडी के बीच समानता होती है।

"एंटीजन एंटीबॉडी" कॉम्प्लेक्स पर पूरक का अवशोषण इसकी विशेषताओं के आधार पर एंटीजन के भाग्य पर अलग-अलग प्रभाव डाल सकता है।

इन परिस्थितियों में कुछ एंटीजन तीव्र रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरते हैं, जिनमें विघटन (हेमोलिसिस, इसेव-फ़िफ़र घटना, साइटोलिटिक क्रिया) शामिल है। अन्य लोग गति की गति बदलते हैं (ट्रेपोनेमा स्थिरीकरण)। फिर भी अन्य लोग अचानक विनाशकारी परिवर्तनों (जीवाणुनाशक या साइटोटोक्सिक प्रभाव) के बिना मर जाते हैं। अंत में, पूरक सोखना आसानी से देखने योग्य एंटीजन परिवर्तनों के साथ नहीं हो सकता है।

आरएससी तंत्र के अनुसार, यह दो चरणों में होता है:

1. पहला चरण "एंटीजन एंटीबॉडी" कॉम्प्लेक्स का निर्माण और इस पूरक कॉम्प्लेक्स पर सोखना है। चरण का परिणाम दृश्यमान नहीं है (पूरक की अनिवार्य भागीदारी के साथ एंटीजन और एंटीबॉडी की बातचीत)।
2. दूसरा चरण पूरक की उपस्थिति में विशिष्ट एंटीबॉडी के प्रभाव में एंटीजन में परिवर्तन है। चरण का परिणाम दृश्य रूप से दिखाई दे सकता है या दिखाई नहीं दे सकता है (एक संकेतक हेमोलिटिक प्रणाली (भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं और हेमोलिटिक सीरम) का उपयोग करके प्रतिक्रिया परिणामों का पता लगाना)।

हेमोलिटिक सीरम द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं का विनाश केवल तभी होता है जब हेमोलिटिक प्रणाली में पूरक जोड़ा जाता है। यदि पूरक को पहले एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स पर अधिशोषित किया गया था, तो एरिथ्रोसाइट्स का हेमोलिसिस नहीं होता है।

प्रयोग के परिणाम का आकलन सभी परीक्षण ट्यूबों में हेमोलिसिस की उपस्थिति या अनुपस्थिति को ध्यान में रखकर किया जाता है। प्रतिक्रिया को सकारात्मक माना जाता है जब हेमोलिसिस पूरी तरह से विलंबित हो जाता है, जब टेस्ट ट्यूब में तरल रंगहीन होता है और लाल रक्त कोशिकाएं नीचे बैठ जाती हैं, नकारात्मक जब लाल रक्त कोशिकाएं पूरी तरह से नष्ट हो जाती हैं, जब तरल तीव्र रंग का होता है ("वार्निश") खून)। हेमोलिसिस देरी की डिग्री का आकलन तरल के रंग की तीव्रता और नीचे लाल रक्त कोशिका तलछट के आकार (++++, +++, ++, +) के आधार पर किया जाता है।

ऐसे मामले में जब एंटीजन में परिवर्तन दृश्य अवलोकन के लिए दुर्गम रहते हैं, तो दूसरी प्रणाली का उपयोग करना आवश्यक होता है, जो एक संकेतक के रूप में कार्य करता है, जिससे व्यक्ति को पूरक की स्थिति का आकलन करने और प्रतिक्रिया के परिणाम के बारे में निष्कर्ष निकालने की अनुमति मिलती है।

यह संकेतक प्रणाली हेमोलिसिस प्रतिक्रिया के घटकों द्वारा दर्शायी जाती है, जिसमें भेड़ एरिथ्रोसाइट्स और हेमोलिटिक सीरम शामिल हैं, जिसमें एरिथ्रोसाइट्स (हेमोलिसिन) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी होते हैं, लेकिन पूरक नहीं होते हैं। मुख्य आरएससी रखे जाने के एक घंटे बाद इस संकेतक प्रणाली को टेस्ट ट्यूब में जोड़ा जाता है। यदि पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया सकारात्मक है, तो एक एंटीबॉडी एंटीजन कॉम्प्लेक्स बनता है, जो पूरक को अपने ऊपर सोख लेता है। चूँकि पूरक का उपयोग केवल एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मात्रा में किया जाता है, और एरिथ्रोसाइट्स का लसीका केवल पूरक की उपस्थिति में हो सकता है, तब जब इसे "एंटीजन एंटीबॉडी" कॉम्प्लेक्स पर अधिशोषित किया जाता है, तो हेमोलिटिक (संकेतक) प्रणाली में एरिथ्रोसाइट्स का लसीका होगा न होना। यदि पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया नकारात्मक है, तो "एंटीजन एंटीबॉडी" कॉम्प्लेक्स नहीं बनता है, पूरक मुक्त रहता है, और जब हेमोलिटिक सिस्टम जोड़ा जाता है, तो एरिथ्रोसाइट लसीका होता है।

1.4. डीएनए जांच. पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर),
इम्यूनोएंजाइम विधि (एलिसा), फ्लोरेसिंग एंटीबॉडी विधि (एफएफए)

जीन जांच के तरीके

आणविक जीव विज्ञान के गहन विकास और आनुवंशिक अनुसंधान के लिए एक आदर्श पद्धतिगत आधार के निर्माण ने आनुवंशिक इंजीनियरिंग का आधार बनाया। निदान के क्षेत्र में, डीएनए और आरएनए के विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम, तथाकथित जीन जांच, को निर्धारित करने के लिए एक दिशा उभरी है और तेजी से विकसित हो रही है। ऐसी तकनीकें पूरक न्यूक्लियोटाइड्स (एटी, जीसी) की परस्पर क्रिया के कारण न्यूक्लिक एसिड के संकरण और डबल-स्ट्रैंडेड संरचनाओं को बनाने की क्षमता पर आधारित हैं।

वांछित डीएनए (या आरएनए) अनुक्रम निर्धारित करने के लिए, एक विशिष्ट आधार अनुक्रम के साथ एक तथाकथित पॉलीन्यूक्लियोटाइड जांच विशेष रूप से बनाई जाती है। इसकी संरचना में एक विशेष लेबल पेश किया गया है, जो परिसर के गठन की पहचान करना संभव बनाता है।

यद्यपि जीन जांच को इम्यूनोकेमिकल विश्लेषण की एक विधि के रूप में वर्गीकृत नहीं किया जा सकता है, लेकिन इसके मूल सिद्धांत (पूरक संरचनाओं की बातचीत) को इम्यूनोडायग्नोस्टिक्स के संकेतक तरीकों के समान तरीके से लागू किया जाता है। इसके अलावा, जीन जांच विधियां किसी संक्रामक एजेंट के बारे में उसकी फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति (जीनोम में एम्बेडेड वायरस, "मूक" जीन) की अनुपस्थिति में जानकारी को फिर से भरना संभव बनाती हैं।

डीएनए विश्लेषण करने के लिए, एकल-फंसे संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए नमूने को विकृत किया जाता है जिसके साथ डीएनए या आरएनए जांच अणु प्रतिक्रिया करते हैं। जांच तैयार करने के लिए, या तो प्राकृतिक स्रोत (उदाहरण के लिए, एक विशेष सूक्ष्मजीव) से अलग किए गए डीएनए (या आरएनए) के विभिन्न खंड, आमतौर पर वेक्टर प्लास्मिड में आनुवंशिक अनुक्रम के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, या रासायनिक रूप से संश्लेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग किया जाता है। कुछ मामलों में, टुकड़ों में हाइड्रोलाइज्ड जीनोमिक डीएनए तैयारी, कभी-कभी आरएनए तैयारी, और विशेष रूप से अक्सर राइबोसोमल आरएनए का उपयोग जांच के रूप में किया जाता है। विभिन्न प्रकार के इम्यूनोकेमिकल विश्लेषण में समान संकेतकों का उपयोग लेबल के रूप में किया जाता है: रेडियोधर्मी आइसोटोप, फ़्लोरेसिन्स, बायोटोप (एविडिन-एंजाइम कॉम्प्लेक्स द्वारा आगे के विकास के साथ), आदि।

विश्लेषण का क्रम उपलब्ध जांच के गुणों द्वारा निर्धारित किया जाता है

वर्तमान में, सभी आवश्यक सामग्रियों से युक्त व्यावसायिक किटों का तेजी से उपयोग किया जा रहा है।

ज्यादातर मामलों में, विश्लेषण प्रक्रिया को निम्नलिखित चरणों में विभाजित किया जा सकता है: नमूना तैयार करना (डीएनए निष्कर्षण और विकृतीकरण सहित), एक वाहक पर नमूना निर्धारण (अक्सर एक बहुलक झिल्ली फिल्टर), प्रीहाइब्रिडाइजेशन, हाइब्रिडाइजेशन स्वयं, अनबाउंड उत्पादों की धुलाई, पता लगाना . मानक डीएनए या आरएनए जांच तैयारी के अभाव में, इसे पहले प्राप्त किया जाता है और लेबल किया जाता है।

एक नमूना तैयार करने के लिए, बैक्टीरिया की अलग-अलग कॉलोनियों की पहचान करने या सेल कल्चर में वायरस की सांद्रता बढ़ाने के लिए परीक्षण सामग्री को प्रारंभिक रूप से "विकसित" करना आवश्यक हो सकता है। संक्रामक एजेंट की उपस्थिति के लिए रक्त सीरम, मूत्र, रक्त कोशिकाओं या पूरे रक्त के नमूनों का प्रत्यक्ष विश्लेषण भी किया जाता है। सेलुलर संरचनाओं से न्यूक्लिक एसिड को मुक्त करने के लिए, कोशिका विश्लेषण किया जाता है, और कुछ मामलों में डीएनए की तैयारी को फिनोल का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है।

डीएनए का विकृतीकरण, यानी इसका एकल-फंसे रूप में संक्रमण, क्षार के साथ इलाज करने पर होता है। फिर न्यूक्लिक एसिड का नमूना एक सहारे, नाइट्रोसेल्यूलोज या नायलॉन झिल्ली पर तय किया जाता है, आमतौर पर वैक्यूम में 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट से 4 घंटे तक ऊष्मायन किया जाता है। इसके अलावा, प्रीहाइब्रिडाइजेशन की प्रक्रिया में, झिल्ली के साथ जांच की गैर-विशिष्ट बातचीत को कम करने के लिए मुक्त बंधन साइटों को निष्क्रिय किया जाता है। नमूने में डीएनए की सांद्रता, प्रयुक्त जांच की सांद्रता और उसके आकार के आधार पर संकरण प्रक्रिया में 2 से 20 घंटे लगते हैं।

संकरण पूरा होने और अनबाउंड उत्पादों के धुल जाने के बाद, गठित कॉम्प्लेक्स का पता लगाया जाता है। यदि जांच में रेडियोधर्मी लेबल होता है, तो प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए, झिल्ली को फोटोग्राफिक फिल्म (ऑटोरैडियोग्राफी) के संपर्क में लाया जाता है। अन्य लेबलों के लिए, संबंधित प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाता है।

सबसे आशाजनक गैर-रेडियोधर्मी (तथाकथित ठंडा) जांच प्राप्त करना है। उसी आधार पर, एक संकरण तकनीक विकसित की जा रही है, जो खंड की तैयारी और ऊतक पंचर में एक रोगज़नक़ की उपस्थिति स्थापित करना संभव बनाती है, जो पैथोमोर्फोलॉजिकल विश्लेषण (सीटू संकरण में) में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

जीन जांच विधियों के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम पोलीमरेज़ एम्प्लीफिकेशन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग था। यह दृष्टिकोण इन विट्रो में कई प्रतियों को संश्लेषित करके एक नमूने में एक विशिष्ट (पूर्व-ज्ञात) डीएनए अनुक्रम की एकाग्रता को बढ़ाना संभव बनाता है। प्रतिक्रिया को अंजाम देने के लिए, एक डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम की तैयारी, संश्लेषण के लिए डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स की अधिकता और तथाकथित प्राइमरों को अध्ययन के तहत डीएनए नमूने में जोड़ा जाता है - दो प्रकार के ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जिनका आकार 2025 आधारों के आकार के अनुरूप होता है जो कि के टर्मिनल अनुभागों के अनुरूप होते हैं। रुचि का डीएनए अनुक्रम। प्राइमरों में से एक रीडिंग दिशा 53 में कोडिंग डीएनए स्ट्रैंड के रीडिंग क्षेत्र की शुरुआत की एक प्रति होनी चाहिए, और दूसरी गैर-कोडिंग स्ट्रैंड के विपरीत छोर की एक प्रति होनी चाहिए। फिर, पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया के प्रत्येक चक्र के साथ, डीएनए प्रतियों की संख्या दोगुनी हो जाती है।

प्राइमर बाइंडिंग प्राप्त करने के लिए, 94°C पर डीएनए विकृतीकरण (पिघलना) आवश्यक है, इसके बाद मिश्रण को 40-55°C पर लाया जाता है।

प्रतिक्रिया को अंजाम देने के लिए, प्रोग्राम करने योग्य माइक्रोसैंपल इनक्यूबेटरों को प्रतिक्रिया के प्रत्येक चरण के लिए इष्टतम तापमान में परिवर्तनों के बीच आसानी से वैकल्पिक करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

प्रवर्धन प्रतिक्रिया जीन जांच के दौरान विश्लेषण की संवेदनशीलता को काफी बढ़ा सकती है, जो संक्रामक एजेंट की कम सांद्रता पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

प्रवर्धन के साथ जीन जांच का एक महत्वपूर्ण लाभ रोग संबंधी सामग्री की सूक्ष्मदर्शी मात्रा का अध्ययन करने की क्षमता है।

विधि की एक अन्य विशेषता, संक्रामक सामग्री के विश्लेषण के लिए अधिक महत्वपूर्ण, छिपे हुए (मूक) जीन की पहचान करने की क्षमता है। जीन जांच के उपयोग से जुड़े तरीकों को निश्चित रूप से संक्रामक रोगों के निदान के अभ्यास में अधिक व्यापक रूप से पेश किया जाएगा क्योंकि वे सरल और सस्ते हो जाएंगे।

एलिसा और आरआईएफ विधियां मुख्यतः गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक प्रकृति की हैं। घटकों की बहुत कम सांद्रता पर, एंटीजन एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के गठन का पता न तो दृष्टि से लगाया जा सकता है और न ही साधारण वाद्य यंत्रों से। ऐसे मामलों में एंटीजन एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स का संकेत तब दिया जा सकता है जब प्रारंभिक घटकों में से एक में एक लेबल पेश किया जाता है एंटीजन या एंटीबॉडी , जिसे विश्लेषणात्मक की निर्धारित एकाग्रता के तुलनीय सांद्रता में आसानी से पता लगाया जा सकता है।

रेडियोधर्मी आइसोटोप (उदाहरण के लिए, 125I), फ्लोरोसेंट पदार्थ और एंजाइम का उपयोग लेबल के रूप में किया जा सकता है।

उपयोग किए गए लेबल के आधार पर, रेडियोइम्यूनोएसे (आरआईए), फ्लोरोसेंट इम्यून (एफआईए), एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) आदि हैं। हाल के वर्षों में, एलिसा को व्यापक व्यावहारिक उपयोग प्राप्त हुआ है, जो मात्रात्मक निर्धारण की संभावना से जुड़ा है। , उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और लेखांकन स्वचालन।

एंजाइम इम्यूनोएसे विधियां विधियों का एक समूह है जो एक सब्सट्रेट का उपयोग करके एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स का पता लगाने की अनुमति देती है जो एक एंजाइम द्वारा साफ किया जाता है और एक रंग पैदा करता है।

विधि का सार एंटीजन एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के घटकों को एक मापा एंजाइम लेबल के साथ जोड़ना है। जो एंटीजन या एंटीबॉडी प्रतिक्रिया करता है उसे एक एंजाइम के साथ लेबल किया जाता है। एंजाइम की क्रिया के तहत सब्सट्रेट के परिवर्तन के आधार पर, कोई एंटीजन एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के अंतःक्रियात्मक घटक की मात्रा का अनुमान लगा सकता है। इस मामले में एंजाइम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है और इसे दृश्य या यंत्रवत् रूप से देखने की अनुमति देता है।

एंजाइम बहुत सुविधाजनक टैग हैं क्योंकि उनके उत्प्रेरक गुण उन्हें एम्पलीफायर के रूप में कार्य करने की अनुमति देते हैं, क्योंकि एक एंजाइम अणु प्रति मिनट उत्प्रेरक प्रतिक्रिया उत्पाद के 1 × 105 से अधिक अणुओं के निर्माण को बढ़ावा दे सकता है। ऐसे एंजाइम का चयन करना आवश्यक है जो लंबे समय तक अपनी उत्प्रेरक गतिविधि को बरकरार रखता है, एंटीजन या एंटीबॉडी से बंधने पर इसे नहीं खोता है, और सब्सट्रेट के संबंध में उच्च विशिष्टता रखता है।

एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी या एंटीजन और संयुग्मों के उत्पादन की मुख्य विधियाँ हैं: रासायनिक, प्रतिरक्षाविज्ञानी और आनुवंशिक इंजीनियरिंग। एलिसा के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले एंजाइम हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेटेज़, गैलेक्टोसिडेज़ आदि हैं।

प्रतिक्रिया की दृश्य और वाद्य रिकॉर्डिंग के उद्देश्य से एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स में एंजाइम गतिविधि का पता लगाने के लिए, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है, जिसके समाधान, शुरू में रंगहीन होते हैं, एंजाइमी प्रतिक्रिया के दौरान रंग प्राप्त करते हैं, जिसकी तीव्रता मात्रा के समानुपाती होती है एंजाइम का. इस प्रकार, ठोस-चरण एलिसा में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज की गतिविधि का पता लगाने के लिए, 5-एमिनोसैलिसिलिक एसिड, जो एक गहरा भूरा रंग पैदा करता है, और ऑर्थो-फेनिलिनेडियम, जो एक नारंगी-पीला रंग पैदा करता है, को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है। क्षारीय फॉस्फेट और β-गैलाटोसिडेज़ की गतिविधि का पता लगाने के लिए, क्रमशः नाइट्रोफेनिलफॉस्फेट और नाइट्रोफेनिलगैलेक्टोसाइड का उपयोग किया जाता है।

रंगीन उत्पाद के निर्माण में प्रतिक्रिया का परिणाम दृष्टिगत रूप से या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है जो एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश के अवशोषण को मापता है।

एलिसा प्रदर्शन के लिए कई विकल्प हैं। सजातीय और विषमांगी विकल्प हैं।

उत्पादन की विधि के अनुसार, प्रतिस्पर्धी और गैर-प्रतिस्पर्धी एलिसा विधियों को प्रतिष्ठित किया जाता है। यदि पहले चरण में केवल विश्लेषण किया गया यौगिक और उसके संबंधित बंधन केंद्र (एंटीजन और विशिष्ट एंटीबॉडी) सिस्टम में मौजूद हैं, तो विधि गैर-प्रतिस्पर्धी है। यदि पहले चरण में विश्लेषण किया गया यौगिक (एंटीजन) और उसका एनालॉग (एंजाइम-लेबल एंटीजन) मौजूद हैं, जो कम आपूर्ति वाले विशिष्ट बंधन केंद्रों (एंटीबॉडी) से जुड़ने के लिए एक-दूसरे के साथ प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं, तो विधि प्रतिस्पर्धी है। इस मामले में, समाधान में जितना अधिक परीक्षण एंटीजन होगा, बाध्य लेबल वाले एंटीजन की संख्या उतनी ही कम होगी।

फ्लोरेसिंग एंटीबॉडीज (एमएफए) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस रिएक्शन (आरआईएफ) की विधि

परीक्षण सामग्री में किसी अज्ञात सूक्ष्मजीव का तेजी से पता लगाने और पहचान करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि पसंद की विधि है।

एजी + एटी + इलेक्ट्रोलाइट = यूवी किरणों में जटिल चमक

फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किया गया सूक्ष्म जीव सीरम

अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली डाई फ़्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट FITC है

इस विधि का अध्ययन करते समय एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है।

स्टेजिंग आरआईएफ

स्मीयर पर FITC-लेबल एंटीबॉडी समाधान का 30 μl लगाया जाता है।

ग्लास को एक नम कक्ष में रखें और इसे कमरे के तापमान पर 20-25 मिनट के लिए रखें, या थर्मोस्टेट में 37°C पर 15 मिनट के लिए रखें।

गिलास को नल के बहते पानी में 2 मिनट तक धोएं, आसुत जल से धोएं और हवा में सुखाएं।

सूखे स्मीयर पर बढ़ते तरल की एक बूंद लगाई जाती है, स्मीयर को एक कवरस्लिप से ढक दिया जाता है और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के लिए एक फ्लोरोसेंट अटैचमेंट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप किया जाता है।

नंबर 29 एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया। घटक, तंत्र, स्थापना विधियाँ। आवेदन पत्र।
एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया- एक साधारण प्रतिक्रिया जिसमें एंटीबॉडी कॉर्पसकुलर एंटीजन (बैक्टीरिया, एरिथ्रोसाइट्स या अन्य कोशिकाएं, उन पर अधिशोषित एंटीजन वाले अघुलनशील कण, साथ ही मैक्रोमोलेक्यूलर समुच्चय) को बांधते हैं। यह इलेक्ट्रोलाइट्स की उपस्थिति में होता है, उदाहरण के लिए, जब एक आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान जोड़ा जाता है।
एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया के विभिन्न प्रकारों का उपयोग किया जाता है: व्यापक, सांकेतिक, अप्रत्यक्ष, आदि। एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया गुच्छे या तलछट (दो या दो से अधिक एंटीजन-बाध्यकारी केंद्रों वाले एंटीबॉडी के साथ "चिपकी हुई" कोशिकाएं - चित्र 13.1) के गठन से प्रकट होती है। आरए का उपयोग इसके लिए किया जाता है:
1) एंटीबॉडी निर्धारणरोगियों के रक्त सीरम में, उदाहरण के लिए, ब्रुसेलोसिस (राइट, हेडेलसन प्रतिक्रिया), टाइफाइड बुखार और पैराटाइफाइड बुखार (विडाल प्रतिक्रिया) और अन्य संक्रामक रोगों के साथ;
2) रोगज़नक़ का निर्धारण, एक मरीज से अलग;
3) रक्त समूह का निर्धारणएरिथ्रोसाइट एलोएंटीजन के विरुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करना।
किसी रोगी में एंटीबॉडी निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया निष्पादित करें:डायग्नोस्टिकम (मारे गए रोगाणुओं का एक निलंबन) को रोगी के रक्त सीरम के तनुकरण में जोड़ा जाता है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटों के ऊष्मायन के बाद, उच्चतम सीरम तनुकरण (सीरम टिटर) नोट किया जाता है, जिस पर एग्लूटिनेशन हुआ, यानी, एक अवक्षेप था बनाया।
एग्लूटिनेशन की प्रकृति और गति एंटीजन और एंटीबॉडी के प्रकार पर निर्भर करती है। एक उदाहरण विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ डायग्नोस्टिकम (ओ- और एच-एंटीजन) की बातचीत की ख़ासियत है। ओ-डायग्नोस्टिकम (गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया, थर्मोस्टेबल ओ-एंटीजन को बनाए रखते हुए) के साथ एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया बारीक दाने वाले एग्लूटिनेशन के रूप में होती है। एच-डायग्नोस्टिकम (फॉर्मेल्डिहाइड द्वारा मारे गए बैक्टीरिया, थर्मोलैबाइल फ्लैगेलर एच-एंटीजन को बनाए रखते हुए) के साथ एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया मोटे होती है और तेजी से आगे बढ़ती है। यदि रोगी से पृथक रोगज़नक़ का निर्धारण करना आवश्यक हो, तो डालें सांकेतिक एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया,डायग्नोस्टिक एंटीबॉडीज (एग्लूटिनेटिंग सीरम) का उपयोग करके, रोगज़नक़ की सीरोटाइपिंग की जाती है। एक सांकेतिक प्रतिक्रिया कांच की स्लाइड पर की जाती है। रोगी से पृथक रोगज़नक़ की एक शुद्ध संस्कृति को 1:10 या 1:20 के कमजोर पड़ने पर डायग्नोस्टिक एग्लूटीनेटिंग सीरम की एक बूंद में जोड़ा जाता है। पास में एक नियंत्रण रखा गया है: सीरम के बजाय, सोडियम क्लोराइड समाधान की एक बूंद लगाई जाती है। जब सीरम और रोगाणुओं के साथ एक बूंद में फ्लोकुलेंट तलछट दिखाई देती है, तो एग्लूटिनेटिंग सीरम के बढ़ते कमजोर पड़ने के साथ टेस्ट ट्यूब में एक विस्तृत एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया की जाती है, जिसमें रोगज़नक़ के निलंबन की 2-3 बूंदें जोड़ी जाती हैं। एग्लूटीनेशन को तलछट की मात्रा और तरल की स्पष्टता की डिग्री के आधार पर ध्यान में रखा जाता है। प्रतिक्रिया को सकारात्मक माना जाता है यदि एग्लूटिनेशन डायग्नोस्टिक सीरम के टिटर के करीब कमजोर पड़ने पर देखा जाता है। उसी समय, नियंत्रणों को ध्यान में रखा जाता है: आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ पतला सीरम पारदर्शी होना चाहिए, एक ही समाधान में रोगाणुओं का निलंबन तलछट के बिना समान रूप से बादलदार होना चाहिए।
विभिन्न संबंधित जीवाणुओं को एक ही डायग्नोस्टिक एग्लूटीनेटिंग सीरम द्वारा एग्लूटीनेट किया जा सकता है, जो
उन्हें पहचानना कठिन हो जाता है। इसलिए, वे इसमें से अधिशोषित एग्लूटिनेटिंग सीरा का उपयोग करते हैं
संबंधित बैक्टीरिया पर सोखकर क्रॉस-रिएक्टिंग एंटीबॉडीज। ऐसे सीरा में संरक्षित रहती हैं एंटीबॉडीज
केवल किसी दिए गए जीवाणु के लिए विशिष्ट।