Une réaction d'agglutination (RA) est l'adhésion et la précipitation de microbes ou d'autres cellules sous l'influence d'anticorps en présence d'un électrolyte. Le précipité obtenu est appelé agglutinat.
La RA est utilisée :
1. Détecter les anticorps dans le sérum sanguin du patient (sérodiagnostic).
2. Déterminer le type et le sérotype d'une culture pure de micro-organismes pathogènes isolés d'un patient (sérotypage).
La réaction d'agglutination est utilisée pour déterminer les anticorps dans le sérum sanguin des patients, par exemple atteints de fièvre typhoïde et de fièvre paratyphoïde (réaction de Vidal), de brucellose (réaction de Wright, Heddleson), de tularémie, de leptospirose et d'autres maladies infectieuses, ainsi que pour déterminer l'agent pathogène isolé chez un patient (infections intestinales, coqueluche, etc.). La PR est utilisée pour déterminer les groupes sanguins, le facteur Rh, etc.
La réaction nécessite les composants suivants :
1. L'antigène (agglutinogène) doit être corpusculaire, c'est-à-dire qu'il s'agit d'une suspension de micro-organismes vivants ou tués (diagnostic m), d'érythrocytes ou d'autres cellules. En règle générale, une culture quotidienne de micro-organismes cultivés sur des géloses inclinées est utilisée. La culture est lavée avec 3 à 4 ml de solution isotonique, transférée dans un tube stérile et la densité est déterminée. La suspension doit être homogène et contenir jusqu'à 3 milliards de cellules microbiennes pour 1 ml. L'utilisation d'une suspension de microbes tués - diagnosticums - facilite le travail (préparé en production).
2. Les anticorps (agglutinines) sont retrouvés dans le sérum du patient (lors du sérodiagnostic) ou dans le sérum agglutinant (lors du sérotypage). Les sérums agglutinants sont obtenus en immunisant des lapins avec des bactéries tuées.
Titre agglutinant le sérum est appelé sa dilution la plus élevée, dans laquelle il réagit avec l'antigène correspondant dans certaines conditions expérimentales.
Les sérums agglutinants peuvent être natifs (non adsorbés) et adsorbés. Les sérums natifs en petites dilutions interagissent non seulement avec le type de micro-organismes avec lesquels l'animal a été immunisé pour obtenir le sérum, mais également avec des types de micro-organismes apparentés, car ils contiennent des anticorps de groupe (anticorps dirigés contre des micro-organismes ayant des antigènes communs). Les sérums natifs sont utilisés pour une réaction d'agglutination détaillée (pour le sérodiagnostic), qui prend en compte non seulement la présence de la réaction, mais également la dynamique d'augmentation du titre d'anticorps.
Si les anticorps de groupe sont extraits (adsorbés) du sérum natif par interaction avec des bactéries apparentées possédant des antigènes de groupe, des sérums adsorbés sont obtenus. Les sérums adsorbés peuvent être monorécepteurs (ou spécifiques d'un type), contenant des anticorps dirigés contre un seul récepteur d'antigène. Les sérums polyvalents sont constitués d'un mélange de plusieurs sérums adsorbés ou non adsorbés. Les sérums adsorbés sont utilisés pour la réaction d'agglutination sur verre.
Lorsque des animaux sont immunisés avec des bactéries mobiles avec l'antigène H, des sérums agglutinants H contenant des anticorps H sont obtenus (par exemple, du sérum agglutinant H pour les monorécepteurs de Salmonella). Par immunisation avec l'antigène O, on obtient des sérums O-agglutinants contenant des anticorps O (par exemple, sérum O-agglutinant adsorbé par le groupe Salmonella, sérum O-agglutinant anticholéra). Par immunisation avec des antigènes H et O, on obtient des sérums contenant des anticorps H et O.
De plus, les O-agglutinines produisent un agglutinat à grains fins et les H-agglutinines produisent un sédiment à gros grains.
3. Électrolyte - solution isotonique de NaCl (solution de chlorure de sodium à 0,9 % préparée dans de l'eau distillée).
Il existe deux méthodes principales pour réaliser une réaction d'agglutination : une réaction sur verre (parfois appelée réaction indicative ou sur plaque) et une réaction détaillée (en tubes à essai).
Mise en place d'une réaction d'agglutination sur verre. Deux gouttes de sérum et une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium sont appliquées sur une lame de verre dégraissée. Le sérum agglutinant diagnostique est pris en une dilution qui, selon son titre, est de 1:10, 1:25, 1:50 ou 1:100. La culture du micro-organisme étudié est ajoutée à une goutte de sérum et une goutte de solution isotonique à l'aide d'une anse et soigneusement mélangée. Une goutte de chlorure de sodium avec des micro-organismes est un contrôle antigénique, une goutte de sérum sans micro-organismes est un contrôle sérique. Vous ne pouvez pas transférer la culture d’une goutte contenant du sérum vers une goutte contenant du NaCl. La réaction a lieu à température ambiante pendant 1 à 3 minutes. Si le contrôle sérique reste clair, une turbidité uniforme est observée dans le contrôle antigène et des flocons d'agglutinat apparaissent dans la goutte où la culture est mélangée avec le sérum, alors le résultat est considéré comme positif. S'il y a une turbidité uniforme dans la goutte contenant le sérum et l'antigène, le résultat est négatif. La réaction est plus clairement visible sur un fond sombre.
Sérum
1. contrôle des antigènes
2. contrôle sérique
L'agglutination est le collage et la précipitation de microbes ou d'autres cellules sous l'influence d'anticorps en présence d'un électrolyte (solution isotonique de chlorure de sodium). Les groupes de bactéries collées (cellules) sont appelés agglutinats. Les composants suivants sont nécessaires à la réaction d'agglutination :
1. Anticorps (agglutinines) présents dans le sérum d’un animal malade ou immunisé.
2. Antigène - une suspension de microbes, de globules rouges ou d'autres cellules vivants ou tués.
3. Solution isotonique (0,9 %) de chlorure de sodium.
La réaction d'agglutination pour le sérodiagnostic est utilisée pour la fièvre typhoïde et la fièvre paratyphoïde (réaction de Vidal), la brucellose (réaction de Wright et Heddleson), la tularémie, etc. L'anticorps est le sérum du patient et l'antigène est un microbe connu. Lors de l'identification de microbes ou d'autres cellules, leur suspension est utilisée comme antigène et un sérum immunitaire connu est utilisé comme anticorps. Cette réaction est largement utilisée pour diagnostiquer les infections intestinales, la coqueluche, etc.
Méthodes de stadification de la PR
RA approximatif sur verre
RA déployé
(méthode du volume)
Réaction de coagulation
RA déplié sur verre (séroidentification)
Réaction d'agglutination sur verre. Deux gouttes de sérum spécifique (adsorbé) et une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium sont appliquées sur une lame de verre sans graisse. Les sérums non adsorbés sont pré-dilués dans un rapport de 1:5 à 1:100. Les gouttes doivent être appliquées sur le verre de manière à ce qu'il y ait une distance entre elles. La culture est soigneusement broyée sur verre avec une anse ou une pipette, puis ajoutée à une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium et à l'une des gouttes de sérum, en remuant dans chacune jusqu'à formation d'une suspension homogène. Une goutte de sérum sans culture est un sérum témoin.
Attention! Vous ne pouvez pas transférer la culture du sérum vers une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium, qui sert de contrôle antigénique. La réaction a lieu à température ambiante pendant 1 à 3 minutes. Si le contrôle sérum reste transparent, une turbidité uniforme est observée dans le contrôle antigène et des flocons d'agglutinat apparaissent dans la goutte où la culture est mélangée avec du sérum sur fond de liquide clair, le résultat de la réaction est considéré comme positif.
Diagnostic Physiologique
sérum + solution de culture + culture
Réaction d'agglutination détaillée (méthode du volume). Des dilutions en série, le plus souvent doubles, de sérum sont préparées. La méthode est dite volumétrique. Pour déterminer le titre d'anticorps dans le sérum sanguin, prenez 6 tubes. Versez 1 ml de la dilution originale de sérum au 1:50 dans le premier tube à essai et ajoutez 1 ml de solution saline dans les 6 tubes à essai à l'aide d'une pipette graduée. Le premier tube à essai donnera une dilution de sérum au 1:100 avec un volume de 2 ml. Transférer 1 ml du premier tube à essai dans le deuxième tube à essai, où la dilution devient 1:200. Faites donc une série de dilutions en série du sérum dans les 5 premiers tubes à essai (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). A partir du cinquième tube à essai, versez 1 ml dans la solution désinfectante. Ajoutez 2 gouttes de diagnosticum dans les 6 tubes à essai. Le sixième tube est un contrôle de culture, car il contient uniquement une solution saline et du diagnosticum.
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Ingrédients |
numéro de tube |
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contrôle sérique |
contrôle diagnostic-kuma |
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Physiologique | |||||||
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Sérum du patient | |||||||
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dilution 1:50 | |||||||
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Diagnosticum (gouttes) | |||||||
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Dilution du sérum | |||||||
Un tel contrôle est nécessaire pour exclure l'agglutination spontanée de la culture. Les tubes sont agités et placés dans un thermostat à une température de 37°C pendant 2 heures, puis laissés une journée à température ambiante, après quoi les résultats de la réaction d'agglutination sont enregistrés. Lors d'une réaction d'agglutination avec des sérums d'enfants au cours des premiers mois de la vie, en raison de l'infériorité fonctionnelle de la formation d'anticorps, il est nécessaire d'identifier des titres d'anticorps plus faibles, qui sont pris en compte lors de la dilution du sérum. La dilution initiale du sérum est de 1:25. Dans le premier tube à essai, on obtient une dilution au 1:50, puis au 1:100, etc.
Si le résultat de la réaction est positif, les tubes à essai montrent des cellules collées sous forme de grains ou de flocons sur fond de liquide clair. L'agglutinat se dépose progressivement au fond sous la forme d'un « parapluie » et le liquide au-dessus du sédiment devient clair. Le contrôle antigénique est uniformément trouble.
Selon la nature du sédiment, on distingue une agglutination à grains fins et grossiers (feuilleteux). Une agglutination à grains fins est obtenue en travaillant avec des O-sera. À gros grains - lorsque les microbes mobiles interagissent avec les sérums H flagellaires. Il se produit plus rapidement que le sédiment à grain fin et le sédiment qui en résulte est très meuble et se brise facilement.
L'intensité de la réaction s'exprime comme suit :
Toutes les cellules se sont déposées, le liquide dans le tube à essai est complètement transparent. Le résultat de la réaction est nettement positif ;
Il y a moins de sédiments, le liquide ne s'éclaircit pas complètement. Le résultat de la réaction est positif ;
Il y a encore moins de sédiments, le liquide est plus trouble. Le résultat de la réaction est douteux ;
Il y a un léger sédiment au fond du tube à essai, le liquide est trouble. Résultat de réaction discutable ;
Il n’y a pas de sédiment, le liquide est uniformément trouble, comme dans le contrôle antigénique. Résultat de réaction négatif
L'agglutination est le collage et la précipitation de microbes ou d'autres cellules sous l'influence d'anticorps en présence d'un électrolyte (solution isotonique de chlorure de sodium). Les groupes de bactéries collées (cellules) sont appelés agglutinats. Les composants suivants sont nécessaires à la réaction d'agglutination :
1. Anticorps (agglutinines) présents dans le sérum d’un animal malade ou immunisé.
2. Antigène - une suspension de microbes, de globules rouges ou d'autres cellules vivants ou tués.
3. Solution isotonique (0,9 %) de chlorure de sodium.
La réaction d'agglutination pour le sérodiagnostic est utilisée pour la fièvre typhoïde et la fièvre paratyphoïde (réaction de Vidal), la brucellose (réaction de Wright et Heddleson), la tularémie, etc. L'anticorps est le sérum du patient et l'antigène est un microbe connu. Lors de l'identification de microbes ou d'autres cellules, leur suspension est utilisée comme antigène et un sérum immunitaire connu est utilisé comme anticorps. Cette réaction est largement utilisée pour diagnostiquer les infections intestinales, la coqueluche, etc.
Méthodes de stadification de la PR
RA approximatif sur verre
RA déployé
(méthode du volume)
Réaction de coagulation
RA déplié sur verre (séroidentification)
Réaction d'agglutination sur verre. Deux gouttes de sérum spécifique (adsorbé) et une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium sont appliquées sur une lame de verre sans graisse. Les sérums non adsorbés sont pré-dilués dans un rapport de 1:5 à 1:100. Les gouttes doivent être appliquées sur le verre de manière à ce qu'il y ait une distance entre elles. La culture est soigneusement broyée sur verre avec une anse ou une pipette, puis ajoutée à une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium et à l'une des gouttes de sérum, en remuant dans chacune jusqu'à formation d'une suspension homogène. Une goutte de sérum sans culture est un sérum témoin.
Attention! Vous ne pouvez pas transférer la culture du sérum vers une goutte de solution isotonique de chlorure de sodium, qui sert de contrôle antigénique. La réaction a lieu à température ambiante pendant 1 à 3 minutes. Si le contrôle sérum reste transparent, une turbidité uniforme est observée dans le contrôle antigène et des flocons d'agglutinat apparaissent dans la goutte où la culture est mélangée avec du sérum sur fond de liquide clair, le résultat de la réaction est considéré comme positif.
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Diagnostic Physiologique
sérum + solution de culture + culture
Réaction d'agglutination détaillée (méthode du volume). Des dilutions en série, le plus souvent doubles, de sérum sont préparées. La méthode est dite volumétrique. Pour déterminer le titre d'anticorps dans le sérum sanguin, prenez 6 tubes. Versez 1 ml de la dilution originale de sérum au 1:50 dans le premier tube à essai et ajoutez 1 ml de solution saline dans les 6 tubes à essai à l'aide d'une pipette graduée. Le premier tube à essai donnera une dilution de sérum au 1:100 avec un volume de 2 ml. Transférer 1 ml du premier tube à essai dans le deuxième tube à essai, où la dilution devient 1:200. Faites donc une série de dilutions en série du sérum dans les 5 premiers tubes à essai (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). A partir du cinquième tube à essai, versez 1 ml dans la solution désinfectante. Ajoutez 2 gouttes de diagnosticum dans les 6 tubes à essai. Le sixième tube est un contrôle de culture, car il contient uniquement une solution saline et du diagnosticum.
Un tel contrôle est nécessaire pour exclure l'agglutination spontanée de la culture. Les tubes sont agités et placés dans un thermostat à une température de 37°C pendant 2 heures, puis laissés une journée à température ambiante, après quoi les résultats de la réaction d'agglutination sont enregistrés. Lors d'une réaction d'agglutination avec des sérums d'enfants au cours des premiers mois de la vie, en raison de l'infériorité fonctionnelle de la formation d'anticorps, il est nécessaire d'identifier des titres d'anticorps plus faibles, qui sont pris en compte lors de la dilution du sérum. La dilution initiale du sérum est de 1:25. Dans le premier tube à essai, on obtient une dilution au 1:50, puis au 1:100, etc.
Si le résultat de la réaction est positif, les tubes à essai montrent des cellules collées sous forme de grains ou de flocons sur fond de liquide clair. L'agglutinat se dépose progressivement au fond sous la forme d'un « parapluie » et le liquide au-dessus du sédiment devient clair. Le contrôle antigénique est uniformément trouble.
Selon la nature du sédiment, on distingue une agglutination à grains fins et grossiers (feuilleteux). Une agglutination à grains fins est obtenue en travaillant avec des O-sera. À gros grains - lorsque les microbes mobiles interagissent avec les sérums H flagellaires. Il se produit plus rapidement que le sédiment à grain fin et le sédiment qui en résulte est très meuble et se brise facilement.
L'intensité de la réaction s'exprime comme suit :
Toutes les cellules se sont déposées, le liquide dans le tube à essai est complètement transparent. Le résultat de la réaction est nettement positif ;
Il y a moins de sédiments, le liquide ne s'éclaircit pas complètement. Le résultat de la réaction est positif ;
Il y a encore moins de sédiments, le liquide est plus trouble. Le résultat de la réaction est douteux ;
Il y a un léger sédiment au fond du tube à essai, le liquide est trouble. Résultat de réaction discutable ;
Il n’y a pas de sédiment, le liquide est uniformément trouble, comme dans le contrôle antigénique. Résultat de réaction négatif
1.1. RÉACTION D'AGGLUTINATION (RA)
RÉACTION D'AGGLUTINATION (RA)
En raison de sa spécificité, de sa facilité de réalisation et de son caractère démonstratif, la réaction d'agglutination s'est généralisée dans la pratique microbiologique pour le diagnostic de nombreuses maladies infectieuses.
La réaction d'agglutination est basée sur la spécificité de l'interaction des anticorps (agglutinines) avec des cellules microbiennes entières ou autres (agglutinogènes). À la suite de cette interaction, des particules et des agglomérats se forment, qui précipitent (s'agglutinent) sous forme de flocons.
La réaction d'agglutination peut impliquer à la fois des bactéries vivantes et tuées, des spirochètes, des champignons, des protozoaires, des rickettsies, ainsi que des globules rouges et d'autres cellules. La réaction se déroule en deux phases : la première (invisible) spécifique, la combinaison d'antigènes et d'anticorps, la seconde (visible) non spécifique, le collage des antigènes, c'est-à-dire formation d'agglutinats.
Un agglutinat se forme lorsqu'un centre actif d'un anticorps divalent se combine avec le groupe déterminant d'un antigène. La réaction d'agglutination, comme toute réaction sérologique, se produit en présence d'électrolytes.
Extérieurement, la manifestation d'une réaction d'agglutination positive a un double caractère. Chez les microbes flagellés qui ne possèdent que l’antigène somatique O2, les cellules microbiennes elles-mêmes se collent directement les unes aux autres. Cette agglutination est dite à grains fins. Cela se produit dans les 18 à 22 heures. v
Les microbes flagellés possèdent deux antigènes : l'antigène somatique O2 et l'antigène flagellaire H2. Si les cellules sont collées ensemble par des flagelles, de gros flocons lâches se forment et cette réaction d'agglutination est appelée à gros grains. Cela se produit dans les 2 à 4 heures.
La réaction d’agglutination peut être réalisée à la fois dans le but de déterminer qualitativement et quantitativement des anticorps spécifiques dans le sérum sanguin du patient et dans le but de déterminer l’espèce de l’agent pathogène isolé. v
La réaction d'agglutination peut être réalisée à la fois dans une version étendue, qui permet de travailler avec du sérum dilué à un titre diagnostique, et dans la version d'une réaction indicative, qui permet, en principe, de détecter des anticorps spécifiques ou de déterminer l'espèce du agent pathogène.
Lors d'une réaction d'agglutination détaillée, afin de détecter des anticorps spécifiques dans le sérum sanguin du sujet, le sérum de test est prélevé à une dilution de 1:50 ou 1:100. Cela est dû au fait que les anticorps normaux peuvent être présents à des concentrations très élevées dans le sérum entier ou légèrement dilué, et que les résultats de la réaction peuvent alors être inexacts. Le matériau testé dans cette version de la réaction est le sang du patient.
Le sang est prélevé à jeun ou au plus tôt 6 heures après un repas (sinon des gouttelettes de graisse peuvent apparaître dans le sérum sanguin, le rendant trouble et impropre à la recherche). Le sérum sanguin du patient est généralement obtenu au cours de la deuxième semaine de la maladie, en collectant stérilement 3 × 4 ml de sang de la veine cubitale (à ce moment-là, la quantité maximale d'anticorps spécifiques est concentrée). Un diagnosticum préparé à partir de cellules microbiennes tuées mais non détruites d'une espèce spécifique avec une structure antigénique spécifique est utilisé comme antigène connu.
Lors d’une réaction d’agglutination détaillée afin de déterminer l’espèce et le type d’agent pathogène, l’antigène est un agent pathogène vivant isolé du matériel étudié. Les anticorps contenus dans le sérum d'immunodiagnostic sont connus. v
Le sérum de diagnostic immunitaire est obtenu à partir du sang d’un lapin vacciné. Après avoir déterminé le titre (la dilution maximale à laquelle les anticorps sont détectés), le sérum de diagnostic est versé dans des ampoules additionnées d'un conservateur. Ce sérum est utilisé pour l'identification par la structure antigénique du pathogène isolé.
OPTIONS DE LA RÉACTION D'AGGLUTINATION
Ces réactions font intervenir des antigènes sous forme de particules (cellules microbiennes, globules rouges et autres antigènes corpusculaires), qui sont collées entre elles par des anticorps et précipitent.
Pour réaliser une réaction d'agglutination (RA), trois composants sont nécessaires : 1) un antigène (agglutinogène) ; 2) anticorps (agglutinine) et 3) électrolyte (solution isotonique de chlorure de sodium).
RÉACTION D'AGGLUTINATION ORIENTATIVE (PLAQUE) (RA)
Un indicatif, ou plaque, RA est placé sur une lame de verre à température ambiante. Pour ce faire, à l'aide d'une pipette Pasteur, appliquez séparément une goutte de sérum à une dilution de 1:10 à 1:20 et une goutte témoin de solution isotonique de chlorure de sodium sur le verre. Des colonies ou une culture quotidienne de bactéries (une goutte de diagnosticum) sont introduites dans les deux boucles bactériologiques et soigneusement mélangées. Les réactions sont prises en compte visuellement au bout de quelques minutes, parfois à l'aide d'une loupe (x5). Avec une PR positive, on note l'apparition de gros et petits flocons dans une goutte de sérum ; avec une PR négative, le sérum reste uniformément trouble.
RÉACTION D'HÉMAGLUTINATION INDIRECTE (PASSIVE) (RNGA, RPGA)
La réaction est réalisée : 1) pour détecter des polysaccharides, des protéines, des extraits de bactéries et d'autres substances hautement dispersées, des rickettsies et des virus, dont les complexes avec les agglutinines ne sont pas visibles dans la PR conventionnelle, ou 2) pour détecter des anticorps dans le sérum des patients pour ces substances hautement dispersées et les plus petits micro-organismes.
Par agglutination indirecte, ou passive, on entend une réaction dans laquelle des anticorps interagissent avec des antigènes pré-adsorbés sur des particules inertes (latex, cellulose, polystyrène, oxyde de baryum, etc. ou globules rouges de mouton, groupe sanguin humain I(0)).
Dans la réaction d’hémagglutination passive (RPHA), les globules rouges sont utilisés comme transporteurs. Les globules rouges chargés d'antigène se collent les uns aux autres en présence d'anticorps spécifiques dirigés contre cet antigène et précipitent. Les érythrocytes sensibilisés à l'antigène sont utilisés dans le RPGA comme diagnostic érythrocytaire pour la détection des anticorps (sérodiagnostic). Si les globules rouges sont chargés d’anticorps (diagnostic d’anticorps érythrocytaires), ils peuvent être utilisés pour détecter des antigènes.
Mise en scène. Une série de dilutions en série de sérum est préparée dans les puits de plaques de polystyrène. Ajouter 0,5 ml de sérum manifestement positif dans l'avant-dernier puits et 0,5 ml de solution physiologique (contrôles) dans le dernier puits. Ajoutez ensuite 0,1 ml de diagnosticum érythrocytaire dilué dans tous les puits, agitez et placez dans un thermostat pendant 2 heures.
Comptabilité. Dans un cas positif, les globules rouges se déposent au fond du trou sous la forme d'une couche uniforme de cellules au bord plié ou déchiqueté (parapluie inversé) ; dans un cas négatif, ils se déposent sous la forme d'un bouton ou d'un anneau ; .
1.2. RÉACTION DE NEUTRALISATION. LYSE,
RÉACTION OPSONOPHAGOCYTAIRE, RÉACTION D'HYPERSENSIBILITÉ
RÉACTION DE NEUTRALISATION DE L'EXOTOXINE AVEC L'ANTITOXINE (RN)
La réaction repose sur la capacité du sérum antitoxique à neutraliser l’effet de l’exotoxine. Il est utilisé pour le titrage des sérums antitoxiques et la détermination des exotoxines.
Lors du titrage du sérum, une certaine dose de la toxine correspondante est ajoutée à différentes dilutions du sérum antitoxique. Lorsque l’antigène est complètement neutralisé et qu’il n’y a plus d’anticorps non dépensés, une floculation initiale se produit. La réaction de floculation peut être utilisée non seulement pour le titrage du sérum (par exemple, diphtérie), mais également pour le titrage des toxines et des anatoxines. La réaction de neutralisation des toxines avec l'antitoxine est d'une grande importance pratique en tant que méthode de détermination de l'activité des sérums thérapeutiques antitoxiques. L'antigène présent dans cette réaction est une véritable exotoxine.
La force du sérum antitoxique est déterminée par les unités conventionnelles d'AE.
1 AE de sérum botulique neutralise 1000 DLM de toxine botulique. La réaction de neutralisation pour déterminer l'espèce ou le type d'exotoxine (pour le diagnostic du tétanos, du botulisme, de la diphtérie, etc.) peut être réalisée in vitro (selon Ramon), et lors de la détermination de la toxigénicité des cellules microbiennes - dans un gel ( selon Ouchterlony).
Réaction de lyse (RL)
L’une des propriétés protectrices de l’immunsérum est sa capacité à dissoudre les microbes ou les éléments cellulaires pénétrant dans l’organisme.
Les anticorps spécifiques qui provoquent la dissolution cellulaire (lyse) sont appelés lysines. Selon la nature de l'antigène, il peut s'agir de bactériolysines, de cytolysines, de spirochétolysines, d'hémolysines, etc.
Les lysines ne manifestent leur effet qu'en présence d'un facteur complémentaire supplémentaire. Le complément, en tant que facteur d'immunité humorale non spécifique, se trouve dans presque tous les fluides corporels, à l'exception du liquide céphalo-rachidien et du liquide de la chambre antérieure de l'œil. Une teneur assez élevée et constante en complément est constatée dans le sérum sanguin humain et en grande quantité dans le sérum sanguin des cobayes. Chez d'autres mammifères, la teneur en complément dans le sérum sanguin est différente.
Le complément est un système complexe de protéines de lactosérum. Il est instable et s'effondre à 55 degrés pendant 30 minutes. A température ambiante, le complément est détruit en deux heures. Très sensible aux secousses prolongées, aux acides et aux rayons ultraviolets. Cependant, le complément est conservé longtemps (jusqu'à six mois) à l'état séché et à basse température. Le complément favorise la lyse des cellules microbiennes et des globules rouges.
Une distinction est faite entre les réactions de bactériolyse et d'hémolyse.
L'essence de la réaction de bactériolyse est que lorsqu'un sérum immunitaire spécifique se combine avec ses cellules microbiennes vivantes homologues correspondantes en présence de complément, une lyse microbienne se produit.
La réaction d'hémolyse est que lorsque les érythrocytes sont exposés à un sérum spécifique qui leur est immunisé (hémolytique) en présence de complément, on observe la dissolution des érythrocytes, c'est-à-dire hémolyse.
La réaction d'hémolyse dans la pratique de laboratoire est utilisée pour déterminer la plage du complément, ainsi que pour prendre en compte les résultats des réactions diagnostiques de fixation du complément. Le titre du complément est sa plus petite quantité, qui provoque la lyse des globules rouges en 30 minutes dans un système hémolytique dans un volume de 2,5 ml. La réaction de lyse, comme toutes les réactions sérologiques, se produit en présence d'un électrolyte.
RÉACTIONS D'HYPERSENSIBILITÉ (ALLERGIQUES)
Certaines formes d'antigènes, lors d'un contact répété avec le corps, peuvent provoquer une réaction spécifique dans sa base, mais incluant des facteurs cellulaires et moléculaires non spécifiques d'une réponse inflammatoire aiguë. Il existe deux formes connues d'hypersensibilité : l'hypersensibilité de type immédiat (IHT) et l'hypersensibilité de type retardé (DTH). Le premier type de réaction se produit avec la participation d'anticorps et la réaction se développe au plus tard 2 heures après un contact répété avec l'allergène. Le deuxième type est réalisé à l'aide de cellules T inflammatoires (Tgc) comme principaux effecteurs de la réaction, assurant l'accumulation de macrophages dans la zone d'inflammation ; la réaction se manifeste après 6 à 8 heures et plus tard.
Le développement d'une réaction d'hypersensibilité est précédé d'une rencontre avec un antigène et de la survenue d'une sensibilisation, c'est-à-dire l'apparition d'anticorps, de lymphocytes activement sensibilisés et d'anticorps cytophiles sensibilisés passivement d'autres leucocytes (macrophages, granulocytes).
Les réactions d'hypersensibilité ont trois phases de développement : immunologique ; pathochimique; physiopathologique.
Dans une première phase spécifique, l'allergène interagit avec des anticorps et (ou) des cellules sensibilisées. Dans la deuxième phase, les substances biologiquement actives sont libérées par les cellules activées. Les médiateurs libérés (histamine, sérotonine, leucotriènes, bradykinine, etc.) provoquent divers effets périphériques caractéristiques du type de réaction correspondant troisième phase.
Réactions d'hypersensibilité de type 4
Les réactions de ce type sont provoquées par des interactions intercellulaires pathogènes de cellules T auxiliaires sensibilisées, de lymphocytes T cytotoxiques (cellules T tueuses) et de cellules activées du système phagocytaire mononucléaire, provoquées par une stimulation prolongée du système immunitaire par des antigènes bactériens, dans lesquels il existe un insuffisance relative du système immunitaire de l'organisme à éliminer les agents pathogènes bactériens de l'environnement interne des maladies infectieuses. Ces réactions d'hypersensibilité provoquent des cavités pulmonaires tuberculeuses, leur nécrose caséeuse et une intoxication générale chez les patients tuberculeux. La granulomatose cutanée dans la tuberculose et la lèpre, en termes morphopathogénétiques, est en grande partie composée de réactions d'hypersensibilité du quatrième type.
L'exemple le plus célèbre d'un quatrième type de réaction d'hypersensibilité est la réaction de Mantoux, qui se développe au site d'injection intradermique de tuberculine chez un patient dont le corps et l'organisme sont sensibilisés aux antigènes mycobactériens. À la suite de la réaction, une papule hyperémique dense avec une nécrose au centre se forme, qui apparaît seulement quelques heures (lentement) après l'injection intradermique de tuberculine. La formation d'une papule commence par la libération de phagocytes mononucléés du sang circulant du lit vasculaire vers les espaces intercellulaires. Dans le même temps, l'émigration des cellules polymorphonucléaires du lit vasculaire commence. Ensuite, l'infiltration des neutrophiles diminue et l'infiltrat commence à être constitué principalement de lymphocytes et de phagocytes mononucléés. Ceci diffère de la réaction de Mantoux de la réaction d'Arthus, dans laquelle des leucocytes majoritairement polymorphonucléaires s'accumulent sur le site de la lésion.
Dans les réactions d'hypersensibilité de type 4, la stimulation à long terme des lymphocytes sensibilisés par des antigènes conduit, aux endroits où se produisent des modifications tissulaires pathologiques, à une libération pathologiquement intense et prolongée de cytokines par les cellules T auxiliaires. La libération intense de cytokines au niveau des locus des lésions tissulaires provoque une hyperactivation des cellules du système phagocytaire mononucléaire qui s'y trouvent, dont beaucoup, dans un état hyperactivé, forment des brins de cellules épithélioïdes, et certaines fusionnent les unes avec les autres pour former des cellules géantes. Les macrophages, à la surface desquels les antigènes bactériens et viraux sont exposés, peuvent être détruits grâce au fonctionnement des Tkillers (tueurs naturels).
Le quatrième type de réaction d'hypersensibilité est induit par la reconnaissance d'un antigène bactérien étranger par les cellules T auxiliaires qui y sont sensibilisées. Une condition nécessaire à la reconnaissance est l'interaction des inducteurs avec les antigènes exposés à la surface des cellules présentatrices d'antigènes après endocytose et traitement des immunogènes étrangers par les phagocytes mononucléés. Une autre condition nécessaire est l’exposition d’antigènes en combinaison avec des molécules de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité. Après la reconnaissance de l'antigène, les cellules auxiliaires sensibilisées libèrent des cytokines et notamment de l'interleukine2, qui active les cellules tueuses naturelles et les phagocytes mononucléés. Les phagocytes mononucléés activés libèrent des enzymes protéolytiques et des radicaux libres d'oxygène qui endommagent les tissus.
Les tests d'allergie cutanée sont des tests permettant de déterminer la sensibilisation du corps aux allergènes, de déterminer son infection, par exemple la tuberculose, la brucellose, le niveau d'immunité collective, par exemple la tularémie. En fonction du site d'administration de l'allergène, il existe : 1) des tests cutanés ; 2) scarifications ; 3) intradermique ; 4) sous-cutané. La réaction clinique à un allergène lors d'un test d'allergie cutanée est divisée en locale, générale et focale, ainsi qu'immédiate et retardée.
Les réactions locales du médiateur de type GNT surviennent au bout de 520 minutes, s'expriment sous forme d'érythème et de cloque, disparaissent au bout de quelques heures, et sont évaluées par la méthode du plus par la taille de l'érythème, mesurée en mm. Les réactions locales du THS surviennent dans les 24 à 48 heures, durent longtemps, apparaissent sous la forme d'un infiltrat, parfois avec une nécrose au centre, et sont évaluées par la taille de l'infiltrat en mm, également à l'aide du système plus. Avec les types de HNT cytotoxiques et immunocomplexes, une hyperémie et une infiltration sont observées après 3 à 4 heures, atteignent un maximum en 6 à 8 heures et disparaissent après environ une journée. Parfois, des réactions combinées sont observées.
1.3. RÉACTION DE FIXATION DU COMPLÉMENT (FFR)
Cette réaction est utilisée dans des études de laboratoire pour détecter des anticorps dans le sérum sanguin pour diverses infections, ainsi que pour identifier l'agent pathogène par sa structure antigénique.
La réaction de fixation du complément est une réaction sérologique complexe et très sensible et spécifique.
Une caractéristique de cette réaction est que la modification de l'antigène lors de son interaction avec des anticorps spécifiques ne se produit qu'en présence de complément. Le complément est adsorbé uniquement sur le complexe « anticorps antigène ». Le complexe « anticorps antigène » ne se forme que s’il existe une affinité entre l’antigène et l’anticorps présents dans le sérum.
L’adsorption du complément sur le complexe « antigène anticorps » peut avoir des effets différents sur le devenir de l’antigène selon ses caractéristiques.
Certains antigènes subissent dans ces conditions de fortes modifications morphologiques, notamment une dissolution (hémolyse, phénomène d'Isaev-Pfeiffer, action cytolytique). D'autres modifient la vitesse de déplacement (immobilisation du tréponème). D'autres encore meurent sans changements destructeurs soudains (effet bactéricide ou cytotoxique). Enfin, l’adsorption du complément peut ne pas s’accompagner de modifications antigéniques facilement observables.
Selon le mécanisme RSC, cela se déroule en deux phases :
- La première phase est la formation du complexe « antigène anticorps » et l’adsorption sur ce complexe complément. Le résultat de la phase n'est pas visuellement visible (interaction de l'antigène et des anticorps avec participation obligatoire du complément).
- La deuxième phase est une modification de l'antigène sous l'influence d'anticorps spécifiques en présence de complément. Le résultat de la phase peut être visible visuellement ou non (détection des résultats de réaction à l'aide d'un système hémolytique indicateur (globules rouges de mouton et sérum hémolytique).
La destruction des globules rouges par le sérum hémolytique ne se produit que si du complément est ajouté au système hémolytique. Si le complément a été préalablement adsorbé sur le complexe antigène-anticorps, l'hémolyse des érythrocytes ne se produit pas.
Le résultat de l'expérience est apprécié en notant la présence ou l'absence d'hémolyse dans tous les tubes à essai. La réaction est considérée comme positive lorsque l'hémolyse est complètement retardée, lorsque le liquide dans l'éprouvette est incolore et que les globules rouges se déposent au fond, négative lorsque les globules rouges sont complètement lysés, lorsque le liquide est intensément coloré (« vernis »). sang). Le degré de retard de l'hémolyse s'apprécie en fonction de l'intensité de la couleur du liquide et de la taille du sédiment érythrocytaire au fond (++++, +++, ++, +).
Dans le cas où les modifications de l'antigène restent inaccessibles à l'observation visuelle, il est nécessaire d'utiliser un deuxième système, qui agit comme un indicateur permettant d'évaluer l'état du complément et de tirer une conclusion sur le résultat de la réaction.
Ce système indicateur est représenté par les composants de la réaction d'hémolyse, qui comprennent les érythrocytes de mouton et le sérum hémolytique, qui contient des anticorps spécifiques dirigés contre les érythrocytes (hémolysines), mais ne contient pas de complément. Ce système indicateur est ajouté aux tubes à essai une heure après la mise en place du RSC principal. Si la réaction de fixation du complément est positive, alors un complexe anticorps-antigène se forme, qui adsorbe le complément sur lui-même. Étant donné que le complément est utilisé dans la quantité nécessaire pour une seule réaction et que la lyse des érythrocytes ne peut se produire qu'en présence de complément, alors lorsqu'il est adsorbé sur le complexe « antigène-anticorps », la lyse des érythrocytes dans le système hémolytique (indicateur) ne se produit pas. Si la réaction de fixation du complément est négative, le complexe « antigène anticorps » ne se forme pas, le complément reste libre et lorsque le système hémolytique est ajouté, une lyse érythrocytaire se produit.
1.4. SONDES ADN. RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE (PCR),
MÉTHODE IMMUNOENZYME (ELISA), MÉTHODE D'ANTICORPS FLUORESCENTES (FFA)
MÉTHODES DE SONDAGE GÉNIQUE
Le développement intensif de la biologie moléculaire et la création d'une base méthodologique parfaite pour la recherche génétique ont constitué la base du génie génétique. Dans le domaine du diagnostic, une direction a émergé et se développe rapidement pour déterminer des séquences nucléotidiques spécifiques de l'ADN et de l'ARN, ce qu'on appelle le sondage génétique. De telles techniques reposent sur la capacité des acides nucléiques à s'hybrider et à former des structures double brin grâce à l'interaction de nucléotides complémentaires (AT, GC).
Pour déterminer la séquence d'ADN (ou d'ARN) souhaitée, une sonde dite polynucléotidique avec une séquence de bases spécifique est spécialement créée. Un label spécial est introduit dans sa composition, ce qui permet d'identifier la formation du complexe.
Bien que le sondage génétique ne puisse être classé comme méthode d'analyse immunochimique, son principe de base (l'interaction de structures complémentaires) est méthodiquement mis en œuvre de la même manière que les méthodes indicatrices d'immunodiagnostic. De plus, les méthodes de sondage génétique permettent de reconstituer les informations sur un agent infectieux en l'absence de son expression phénotypique (virus intégrés dans le génome, gènes « silencieux »).
Pour réaliser l'analyse de l'ADN, l'échantillon est dénaturé afin d'obtenir des structures simple brin avec lesquelles réagissent les molécules sondes d'ADN ou d'ARN. Pour préparer les sondes, on utilise soit diverses sections d'ADN (ou d'ARN) isolées d'une source naturelle (par exemple, un micro-organisme particulier), généralement présentées sous forme de séquences génétiques dans des plasmides vecteurs, soit des oligonucléotides synthétisés chimiquement. Dans certains cas, des préparations d'ADN génomique hydrolysées en fragments sont utilisées comme sonde, parfois des préparations d'ARN, et surtout souvent de l'ARN ribosomal. Les mêmes indicateurs sont utilisés comme marqueur que dans différents types d'analyses immunochimiques : isotopes radioactifs, fluorescéines, biotope (avec développement ultérieur par le complexe avidine-enzyme), etc.
L'ordre d'analyse est déterminé par les propriétés de la sonde disponible
Actuellement, les kits commerciaux contenant tous les ingrédients nécessaires sont de plus en plus utilisés.
Dans la plupart des cas, la procédure d'analyse peut être divisée en les étapes suivantes : préparation de l'échantillon (y compris l'extraction et la dénaturation de l'ADN), fixation de l'échantillon sur un support (le plus souvent un filtre à membrane polymère), préhybridation, hybridation elle-même, lavage des produits non liés, détection . En l’absence d’une préparation standard de sonde d’ADN ou d’ARN, celle-ci est d’abord obtenue et étiquetée.
Pour préparer un échantillon, il peut être nécessaire de « cultiver » au préalable le matériel de test pour identifier des colonies individuelles de bactéries ou augmenter la concentration de virus dans une culture cellulaire. Une analyse directe d'échantillons de sérum sanguin, d'urine, de cellules sanguines ou de sang total pour détecter la présence d'un agent infectieux est également effectuée. Pour libérer les acides nucléiques des structures cellulaires, une lyse cellulaire est effectuée et, dans certains cas, la préparation d'ADN est purifiée à l'aide de phénol.
La dénaturation de l'ADN, c'est-à-dire sa transition vers une forme simple brin, se produit lorsqu'il est traité avec un alcali. L'échantillon d'acide nucléique est ensuite fixé sur un support, une membrane de nitrocellulose ou de nylon, généralement par incubation pendant 10 minutes à 4 heures à 80°C sous vide. De plus, au cours du processus de préhybridation, l'inactivation des sites de liaison libres est obtenue afin de réduire l'interaction non spécifique de la sonde avec la membrane. Le processus d'hybridation dure de 2 à 20 heures, selon la concentration d'ADN dans l'échantillon, la concentration de la sonde utilisée et sa taille.
Une fois l'hybridation terminée et les produits non liés éliminés, le complexe formé est détecté. Si la sonde contient un marqueur radioactif, pour démontrer la réaction, la membrane est exposée à un film photographique (autoradiographie). Pour les autres labels, les procédures appropriées sont utilisées.
Le plus prometteur est d’obtenir des sondes non radioactives (dites froides). Sur cette même base, une technique d'hybridation est en cours de développement, qui permet d'établir la présence d'un pathogène dans les préparations de coupes et les ponctions tissulaires, ce qui est particulièrement important en analyse pathomorphologique (hybridation in situ).
Une étape importante dans le développement des méthodes de sondage génétique a été l’utilisation de la réaction d’amplification par polymérase (PCR). Cette approche permet d'augmenter la concentration d'une séquence d'ADN spécifique (pré-connue) dans un échantillon en synthétisant plusieurs copies in vitro. Pour réaliser la réaction, une préparation enzymatique ADN polymérase, un excès de désoxynucléotides pour la synthèse et ce que l'on appelle des amorces sont ajoutés à l'échantillon d'ADN étudié - deux types d'oligonucléotides d'une taille de 2025 bases correspondant aux sections terminales du Séquence d'ADN d'intérêt. L'une des amorces doit être une copie du début de la région de lecture du brin d'ADN codant dans la direction de lecture 53, et la seconde doit être une copie de l'extrémité opposée du brin non codant. Ensuite, à chaque cycle de la réaction polymérase, le nombre de copies d’ADN double.
Pour obtenir la liaison de l'amorce, une dénaturation (fusion) de l'ADN à 94°C est nécessaire, suivie d'un transport du mélange à 40-55°C.
Pour réaliser la réaction, des incubateurs de microéchantillons programmables ont été conçus pour alterner facilement entre les changements de température optimale pour chaque étape de la réaction.
La réaction d'amplification peut augmenter considérablement la sensibilité de l'analyse lors du sondage génétique, ce qui est particulièrement important à de faibles concentrations de l'agent infectieux.
L’un des avantages significatifs du sondage génétique avec amplification est la capacité d’étudier des quantités submicroscopiques de matériel pathologique.
Une autre caractéristique de la méthode, plus importante pour l’analyse du matériel infectieux, est la capacité d’identifier des gènes cachés (silencieux). Les méthodes associées à l'utilisation du sondage génétique seront certainement plus largement introduites dans la pratique du diagnostic des maladies infectieuses à mesure qu'elles deviendront plus simples et moins coûteuses.
Les méthodes ELISA et RIF sont en grande partie de nature qualitative ou semi-quantitative. À de très faibles concentrations de composants, la formation du complexe antigène-anticorps ne peut être détectée ni visuellement ni par de simples moyens instrumentaux. L'indication du complexe antigène-anticorps dans de tels cas peut être effectuée si un marqueur est introduit dans l'un des composants initiaux antigène ou anticorps , qui peut être facilement détecté à des concentrations comparables à la concentration déterminée de l'analyte.
Les isotopes radioactifs (par exemple 125I), les substances fluorescentes et les enzymes peuvent être utilisés comme marqueurs.
Selon le marqueur utilisé, il existe des tests radio-immunologiques (RIA), immunofluorescents (FIA), tests immuno-enzymatiques (ELISA), etc. Ces dernières années, l'ELISA a reçu une utilisation pratique généralisée, qui est associée à la possibilité de déterminations quantitatives. , haute sensibilité, spécificité et automatisation comptable.
Les méthodes de dosage immunoenzymatique sont un groupe de méthodes qui permettent la détection du complexe antigène-anticorps à l'aide d'un substrat clivé par une enzyme et produisant une couleur.
L'essence de la méthode consiste à combiner les composants de la réaction antigène-anticorps avec un marqueur enzymatique mesuré. L'antigène ou l'anticorps qui réagit est marqué avec une enzyme. Sur la base de la transformation du substrat sous l'action de l'enzyme, on peut juger de la quantité de composant en interaction dans la réaction antigène-anticorps. L'enzyme sert dans ce cas de marqueur de la réaction immunitaire et permet de l'observer visuellement ou instrumentalement.
Les enzymes sont des marqueurs très pratiques car leurs propriétés catalytiques leur permettent d’agir comme des amplificateurs, puisqu’une molécule d’enzyme peut favoriser la formation de plus de 1 × 105 molécules de produit de réaction catalytique par minute. Il est nécessaire de sélectionner une enzyme qui conserve longtemps son activité catalytique, ne la perd pas lors de la liaison à un antigène ou un anticorps et présente une spécificité élevée par rapport au substrat.
Les principales méthodes de production d'anticorps ou d'antigènes et de conjugués marqués par des enzymes sont : le génie chimique, immunologique et génétique. Les enzymes les plus souvent utilisées pour l'ELISA sont la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la galactosidase, etc.
Pour détecter l'activité enzymatique dans le complexe antigène-anticorps à des fins d'enregistrement visuel et instrumental de la réaction, on utilise des substrats chromogènes dont les solutions, initialement incolores, acquièrent au cours de la réaction enzymatique une couleur dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'enzyme. Ainsi, pour détecter l'activité de la peroxydase de raifort dans l'ELISA en phase solide, l'acide 5-aminosalicylique, qui produit une couleur brune intense, et l'ortho-phénylènediamine, qui produit une couleur jaune orangé, sont utilisés comme substrat. Pour détecter l'activité de la phosphatase alcaline et de la β-galatosidase, des nitrophénylphosphates et des nitrophénylgalactosides sont utilisés respectivement.
Le résultat de la réaction dans la formation d'un produit coloré est déterminé visuellement ou à l'aide d'un spectrophotomètre qui mesure l'absorption de la lumière avec une certaine longueur d'onde.
Il existe de nombreuses options pour réaliser l’ELISA. Il existe des options homogènes et hétérogènes.
Sur la base de la méthode utilisée, une distinction est faite entre les méthodes ELISA compétitives et non compétitives. Si, dans un premier temps, seul le composé analysé et ses centres de liaison correspondants (antigène et anticorps spécifiques) sont présents dans le système, alors la méthode n'est pas compétitive. Si, au premier stade, le composé analysé (antigène) et son analogue (antigène marqué par une enzyme) sont présents et se font concurrence pour se lier aux centres de liaison spécifiques (anticorps) qui sont rares, alors la méthode est compétitive. Dans ce cas, plus la solution contient d’antigène à tester, plus le nombre d’antigènes marqués liés est faible.
MÉTHODE DE FLUORESCENCE D'ANTICORPS (MFA) ou DE RÉACTION D'IMMUNOFLUORESCENCE (RIF)
La méthode d'immunofluorescence est la méthode de choix pour la détection et l'identification rapides d'un micro-organisme inconnu dans le matériel de test.
Ag + AT + électrolyte = complexe brillant aux rayons UV
Sérum microbien marqué au fluorochrome
Le colorant souvent utilisé est l'isothiocyanate de fluorescéine FITC.
Lors de l'étude de cette méthode, un microscope à fluorescence est utilisé.
RIF intermédiaire
30 µl de solution d’anticorps marqué au FITC sont appliqués sur le frottis.
Placez le verre dans une chambre humide et conservez-le à température ambiante pendant 20-25 minutes, ou dans un thermostat à 37°C pendant 15 minutes.
Lavez le verre à l'eau courante du robinet pendant 2 minutes, rincez à l'eau distillée et séchez à l'air.
Une goutte de liquide de montage est appliquée sur le frottis séché, le frottis est recouvert d'une lamelle et examiné au microscope à l'aide d'un microscope à fluorescence ou d'un accessoire fluorescent sur un microscope optique conventionnel.
N° 29 Réaction d'agglutination. Composants, mécanisme, méthodes d'installation. Application.
Réaction d'agglutination- une réaction simple dans laquelle les anticorps se lient à des antigènes corpusculaires (bactéries, érythrocytes ou autres cellules, particules insolubles sur lesquelles sont adsorbés des antigènes, ainsi que des agrégats macromoléculaires). Cela se produit en présence d'électrolytes, par exemple lorsqu'une solution isotonique de chlorure de sodium est ajoutée.
Différentes variantes de la réaction d'agglutination sont utilisées : extensive, indicative, indirecte, etc. La réaction d'agglutination se manifeste par la formation de flocons ou de sédiments (cellules « collées » avec des anticorps ayant deux ou plusieurs centres de liaison à l'antigène - Fig. 13.1). RA est utilisé pour :
1) déterminations d'anticorps dans le sérum sanguin de patients atteints, par exemple, de brucellose (réaction de Wright, Heddelson), de fièvre typhoïde et de fièvre paratyphoïde (réaction de Vidal) et d'autres maladies infectieuses ;
2) déterminer l'agent pathogène, isolé d'un patient ;
3) détermination des groupes sanguins en utilisant des anticorps monoclonaux contre les alloantigènes érythrocytaires.
Pour déterminer les anticorps chez un patient effectuer une réaction d'agglutination détaillée : Le Diagnosticum (une suspension de microbes tués) est ajouté aux dilutions du sérum sanguin du patient, et après plusieurs heures d'incubation à 37 °C, la dilution sérique la plus élevée (titre sérique) est notée, à laquelle l'agglutination s'est produite, c'est-à-dire qu'un précipité a été formé.
La nature et la vitesse de l'agglutination dépendent du type d'antigène et d'anticorps. Un exemple est les particularités de l'interaction des diagnosticums (antigènes O et H) avec des anticorps spécifiques. La réaction d'agglutination avec l'O-diagnosticum (bactérie tuée par la chaleur, retenant l'antigène O thermostable) se produit sous la forme d'une agglutination à grain fin. La réaction d'agglutination avec H-diagnosticum (bactéries tuées par le formaldéhyde, retenant l'antigène H flagellaire thermolabile) est grossière et se déroule plus rapidement. S'il est nécessaire de déterminer l'agent pathogène isolé du patient, mettre réaction d'agglutination indicative,à l'aide d'anticorps diagnostiques (sérum agglutinant), c'est-à-dire qu'un sérotypage de l'agent pathogène est effectué. Une réaction indicative est réalisée sur une lame de verre. Une culture pure du pathogène isolé du patient est ajoutée à une goutte de sérum agglutinant diagnostique à une dilution de 1:10 ou 1:20. Un contrôle est placé à proximité : à la place du sérum, une goutte de solution de chlorure de sodium est appliquée. Lorsqu'un sédiment floculant apparaît dans une goutte contenant du sérum et des microbes, une réaction d'agglutination détaillée est effectuée dans des tubes à essai avec des dilutions croissantes du sérum agglutinant, auxquelles sont ajoutées 2 à 3 gouttes d'une suspension de l'agent pathogène. L'agglutination est prise en compte par la quantité de sédiments et le degré de clarté du liquide. La réaction est considérée comme positive si une agglutination est observée dans une dilution proche du titre du sérum diagnostique. Parallèlement, des contrôles sont pris en compte : le sérum dilué avec une solution isotonique de chlorure de sodium doit être transparent, la suspension de microbes dans la même solution doit être uniformément trouble, sans sédiments.
Différentes bactéries apparentées peuvent être agglutinées par le même sérum agglutinant diagnostique, qui
les rend difficiles à identifier. Ils utilisent donc des sérums agglutinants adsorbés à partir desquels
anticorps à réaction croisée par adsorption sur des bactéries apparentées. Les anticorps sont conservés dans ces sérums,
spécifique uniquement à une bactérie donnée.
