Aglutinačná reakcia (RA) je adhézia a precipitácia mikróbov alebo iných buniek pod vplyvom protilátok v prítomnosti elektrolytu. Výsledná zrazenina sa nazýva aglutinát.
RA sa používa:
1. Na zistenie protilátok v krvnom sére pacienta (sérodiagnostika).
2. Stanoviť typ a sérovar čistej kultúry patogénnych mikroorganizmov izolovaných od pacienta (sérotypizácia).
Aglutinačná reakcia sa používa na stanovenie protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brušným týfusom a paratýfusom (Vidalova reakcia), brucelózou (Wrightova, Heddlesonova reakcia), tularémiou, leptospirózou a inými infekčnými ochoreniami, ako aj na stanovenie patogén izolovaný z pacienta (črevné infekcie, čierny kašeľ atď.). RA sa používa na stanovenie krvných skupín, Rh faktora atď.
Reakcia vyžaduje nasledujúce zložky:
1. Antigén (aglutinogén) musí byť korpuskulárny, to znamená, že ide o suspenziu živých alebo usmrtených mikroorganizmov (diagnostika m), erytrocytov alebo iných buniek. Typicky sa používa denná kultúra mikroorganizmov pestovaných na šikmom agare. Kultúra sa premyje 3 - 4 ml izotonického roztoku, prenesie sa do sterilnej skúmavky a stanoví sa hustota. Suspenzia musí byť homogénna a obsahovať až 3 miliardy mikrobiálnych buniek na 1 ml. Prácu uľahčuje použitie suspenzie usmrtených mikróbov – diagnosticums (pripravených vo výrobe).
2. Protilátky (aglutiníny) sa nachádzajú v sére pacienta (počas sérodiagnostiky) alebo v aglutinujúcom sére (počas sérotypizácie). Aglutinačné séra sa získavajú imunizáciou králikov usmrtenými baktériami.
Aglutinačný titer sérum sa nazýva jeho najvyššie riedenie, v ktorom za určitých experimentálnych podmienok reaguje s príslušným antigénom.
Aglutinačné séra môžu byť natívne (neadsorbované) a adsorbované. Natívne séra v malých riedeniach interagujú nielen s typom mikroorganizmov, ktorými bolo zviera imunizované na získanie séra, ale aj s príbuznými typmi mikroorganizmov, pretože obsahujú skupinové protilátky (protilátky proti mikroorganizmom, ktoré majú spoločné antigény). Na podrobnú aglutinačnú reakciu (na sérodiagnostiku), ktorá zohľadňuje nielen prítomnosť reakcie, ale aj dynamiku nárastu titra protilátok, sa používajú natívne séra.
Ak sa skupinové protilátky extrahujú (adsorbujú) z natívneho séra interakciou s príbuznými baktériami, ktoré majú skupinové antigény, získajú sa adsorbované séra. Adsorbované séra môžu byť monoreceptorové (alebo typovo špecifické), obsahujúce protilátky len proti jednému antigénnemu receptoru. Polyvalentné séra pozostávajú zo zmesi niekoľkých adsorbovaných alebo neadsorbovaných sér. Adsorbované séra sa používajú na aglutináciu skla.
Keď sú zvieratá imunizované pohyblivými baktériami s H-antigénom, získajú sa H-aglutinačné séra obsahujúce H-protilátky (napríklad H-aglutinačné sérum Salmonella monoreceptor). Imunizáciou O-antigénom sa získajú O-aglutinačné séra obsahujúce O-protilátky (napríklad O-aglutinačné sérum adsorbované na skupinu Salmonella, O-aglutinačné sérum proti cholere). Imunizáciou H- a O-antigénmi sa získajú séra s H- a O-protilátkami.
Okrem toho O-aglutiníny produkujú jemnozrnný aglutinát a H-aglutiníny vytvárajú hrubozrnný sediment.
3. Elektrolyt – izotonický roztok NaCl (0,9% roztok chloridu sodného pripravený v destilovanej vode).
Existujú dve hlavné metódy na uskutočnenie aglutinačnej reakcie: reakcia na skle (niekedy nazývaná indikatívna alebo tanierová reakcia) a podrobná reakcia (v skúmavkách)
Nastavenie aglutinačnej reakcie na skle. Dve kvapky séra a kvapka izotonického roztoku chloridu sodného sa aplikujú na podložné sklíčko bez tuku. Diagnostické aglutinačné sérum sa odoberá v jednom riedení, ktoré je v závislosti od jeho titra 1:10, 1:25, 1:50 alebo 1:100. Kultúra skúmaného mikroorganizmu sa pomocou slučky pridá do jednej kvapky séra a kvapky izotonického roztoku a dôkladne sa premieša. Kvapka chloridu sodného s mikroorganizmami je kontrola antigénu, kvapka séra bez mikroorganizmov je kontrola séra. Kultúru nemôžete preniesť z kvapky so sérom do kvapky s NaCl. Reakcia prebieha pri teplote miestnosti počas 1-3 minút. Ak kontrola séra zostane číra, v antigénovej kontrole sa pozoruje rovnomerný zákal a v kvapke, kde je kultúra zmiešaná so sérom, sa objavia aglutinačné vločky, potom sa výsledok považuje za pozitívny. Ak je v kvapke rovnomerný zákal so sérom a antigénom, potom je to negatívny výsledok. Reakcia je zreteľnejšie viditeľná na tmavom pozadí.
Sérum
1. kontrola antigénu
2. kontrola séra
Aglutinácia je zlepenie a precipitácia mikróbov alebo iných buniek pod vplyvom protilátok v prítomnosti elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Skupiny zlepených baktérií (bunky) sa nazývajú aglutináty. Na aglutináciu sú potrebné tieto zložky:
1. Protilátky (aglutiníny), ktoré sa nachádzajú v sére chorého alebo imúnneho zvieraťa.
2. Antigén – suspenzia živých alebo usmrtených mikróbov, červených krviniek alebo iných buniek.
3. Izotonický (0,9 %) roztok chloridu sodného.
Aglutinačná reakcia na sérodiagnostiku sa používa pri brušnom týfuse a paratýfuse (Vidalova reakcia), brucelóze (Wrightova a Heddlesonova reakcia), tularémii atď. Protilátkou je sérum pacienta a antigén je známy mikrób. Pri identifikácii mikróbov alebo iných buniek sa ich suspenzia používa ako antigén a ako protilátka sa používa známe imunitné sérum. Táto reakcia sa široko používa na diagnostiku črevných infekcií, čierneho kašľa atď.
Metódy stagingu RA
Približná RA na skle
Nasadený RA
(metóda objemu)
Koaglutinačná reakcia
Rozvinutá RA na skle (séroidentifikácia)
Aglutinačná reakcia na skle. Dve kvapky špecifického (adsorbovaného) séra a kvapka izotonického roztoku chloridu sodného sa aplikujú na podložné sklíčko bez tuku. Neadsorbované séra sú predriedené v pomere 1:5 - 1:100. Kvapky sa musia aplikovať na sklo tak, aby medzi nimi bola vzdialenosť. Kultúra sa dôkladne rozomelie na skle pomocou slučky alebo pipety a potom sa pridá ku kvapke izotonického roztoku chloridu sodného a jednej z kvapiek séra, pričom sa každá z nich mieša, kým sa nevytvorí homogénna suspenzia. Kvapka séra bez kultúry je kontrola séra.
Pozor! Kultúru zo séra nemôžete preniesť do kvapky izotonického roztoku chloridu sodného, ktorý slúži ako kontrola antigénu. Reakcia prebieha pri teplote miestnosti počas 1-3 minút. Ak kontrola séra zostane priehľadná, v antigénovej kontrole sa pozoruje rovnomerný zákal a v kvapke, kde sa kultúra zmiešava so sérom na pozadí čírej tekutiny, sa objavia aglutinačné vločky, výsledok reakcie sa považuje za pozitívny.
Diagnostické fyziologické
sérum + kultivačný roztok + kultivácia
Podrobná aglutinačná reakcia (objemová metóda). Pripravujú sa sériové, najčastejšie dvojnásobné, riedenia séra. Metóda sa nazýva volumetrická. Na stanovenie titra protilátok v krvnom sére odoberte 6 skúmaviek. Do prvej skúmavky nalejte 1 ml pôvodného riedenia séra 1:50 a pomocou odmernej pipety pridajte 1 ml fyziologického roztoku do všetkých 6 skúmaviek. Prvá skúmavka poskytne riedenie séra 1:100 s objemom 2 ml. Preneste 1 ml z prvej skúmavky do druhej skúmavky, kde je riedenie 1:200. Preto urobte sériu sériových riedení séra v prvých 5 skúmavkách (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Z piatej skúmavky nalejte 1 ml do dezinfekčného roztoku. Pridajte 2 kvapky diagnostika do všetkých 6 skúmaviek. Šiesta skúmavka je kultivačná kontrola, pretože obsahuje iba fyziologický roztok a diagnostikum.
|
Ingrediencie |
číslo trubice |
||||||
|
kontrola séra |
ovládanie diagnostic-kuma |
||||||
|
Fyziologické | |||||||
|
Sérum pacienta | |||||||
|
riedenie 1:50 | |||||||
|
Diagnostika (kvapky) | |||||||
|
Riedenie séra | |||||||
Takáto kontrola je potrebná na vylúčenie spontánnej aglutinácie kultúry. Skúmavky sa pretrepú a umiestnia sa do termostatu pri teplote 37 °C na 2 hodiny a potom sa nechajú jeden deň pri teplote miestnosti, po čom sa zaznamenajú výsledky aglutinačnej reakcie. Pri vykonávaní aglutinačnej reakcie so sérami detí v prvých mesiacoch života je z dôvodu funkčnej menejcennosti tvorby protilátok potrebné identifikovať nižšie titre protilátok, čo sa berie do úvahy pri riedení séra. Počiatočné riedenie séra je 1:25. V prvej skúmavke sa získa riedenie 1:50, potom 1:100 atď.
Ak je výsledok reakcie pozitívny, skúmavky ukazujú uviaznuté bunky vo forme zŕn alebo vločiek na pozadí čírej tekutiny. Aglutinát sa postupne usadzuje na dne vo forme „dáždnika“ a kvapalina nad sedimentom sa stáva čírou. Antigénna kontrola je rovnomerne zakalená.
Podľa charakteru sedimentu sa rozlišuje jemno- a hrubozrnná (vločková) aglutinácia. Pri práci s O-sérami sa dosiahne jemnozrnná aglutinácia. Hrubozrnné - keď pohyblivé mikróby interagujú s bičíkovými H-sérami. Vyskytuje sa rýchlejšie ako jemnozrnný a výsledný sediment je veľmi voľný a ľahko sa rozbije.
Intenzita reakcie je vyjadrená takto:
Všetky bunky sa usadili, kvapalina v skúmavke je úplne priehľadná. Výsledok reakcie je ostro pozitívny;
Sedimentov je menej, kvapalina sa úplne nevyčistí. Výsledok reakcie je pozitívny;
Sedimentov je ešte menej, kvapalina je zakalená. Výsledok reakcie je pochybný;
Na dne skúmavky je mierny sediment, kvapalina je zakalená. Pochybný výsledok reakcie;
Neexistuje žiadny sediment, kvapalina je rovnomerne zakalená, ako v prípade kontroly antigénu. Výsledok negatívnej reakcie
Aglutinácia je zlepenie a precipitácia mikróbov alebo iných buniek pod vplyvom protilátok v prítomnosti elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Skupiny zlepených baktérií (bunky) sa nazývajú aglutináty. Na aglutináciu sú potrebné tieto zložky:
1. Protilátky (aglutiníny), ktoré sa nachádzajú v sére chorého alebo imúnneho zvieraťa.
2. Antigén – suspenzia živých alebo usmrtených mikróbov, červených krviniek alebo iných buniek.
3. Izotonický (0,9 %) roztok chloridu sodného.
Aglutinačná reakcia na sérodiagnostiku sa používa pri brušnom týfuse a paratýfuse (Vidalova reakcia), brucelóze (Wrightova a Heddlesonova reakcia), tularémii atď. Protilátkou je sérum pacienta a antigén je známy mikrób. Pri identifikácii mikróbov alebo iných buniek sa ich suspenzia používa ako antigén a ako protilátka sa používa známe imunitné sérum. Táto reakcia sa široko používa na diagnostiku črevných infekcií, čierneho kašľa atď.
Metódy stagingu RA
Približná RA na skle
Nasadený RA
(metóda objemu)
Koaglutinačná reakcia
Rozvinutá RA na skle (séroidentifikácia)
Aglutinačná reakcia na skle. Dve kvapky špecifického (adsorbovaného) séra a kvapka izotonického roztoku chloridu sodného sa aplikujú na podložné sklíčko bez tuku. Neadsorbované séra sú predriedené v pomere 1:5 - 1:100. Kvapky sa musia aplikovať na sklo tak, aby medzi nimi bola vzdialenosť. Kultúra sa dôkladne rozomelie na skle pomocou slučky alebo pipety a potom sa pridá ku kvapke izotonického roztoku chloridu sodného a jednej z kvapiek séra, pričom sa každá z nich mieša, kým sa nevytvorí homogénna suspenzia. Kvapka séra bez kultúry je kontrola séra.
Pozor! Kultúru zo séra nemôžete preniesť do kvapky izotonického roztoku chloridu sodného, ktorý slúži ako kontrola antigénu. Reakcia prebieha pri teplote miestnosti počas 1-3 minút. Ak kontrola séra zostane priehľadná, v antigénovej kontrole sa pozoruje rovnomerný zákal a v kvapke, kde sa kultúra zmiešava so sérom na pozadí čírej tekutiny, sa objavia aglutinačné vločky, výsledok reakcie sa považuje za pozitívny.
 |
Diagnostické fyziologické
sérum + kultivačný roztok + kultivácia
Podrobná aglutinačná reakcia (objemová metóda). Pripravujú sa sériové, najčastejšie dvojnásobné, riedenia séra. Metóda sa nazýva volumetrická. Na stanovenie titra protilátok v krvnom sére odoberte 6 skúmaviek. Do prvej skúmavky nalejte 1 ml pôvodného riedenia séra 1:50 a pomocou odmernej pipety pridajte 1 ml fyziologického roztoku do všetkých 6 skúmaviek. Prvá skúmavka poskytne riedenie séra 1:100 s objemom 2 ml. Preneste 1 ml z prvej skúmavky do druhej skúmavky, kde je riedenie 1:200. Preto urobte sériu sériových riedení séra v prvých 5 skúmavkách (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Z piatej skúmavky nalejte 1 ml do dezinfekčného roztoku. Pridajte 2 kvapky diagnostika do všetkých 6 skúmaviek. Šiesta skúmavka je kultivačná kontrola, pretože obsahuje iba fyziologický roztok a diagnostikum.
Takáto kontrola je potrebná na vylúčenie spontánnej aglutinácie kultúry. Skúmavky sa pretrepú a umiestnia sa do termostatu pri teplote 37 °C na 2 hodiny a potom sa nechajú jeden deň pri teplote miestnosti, po čom sa zaznamenajú výsledky aglutinačnej reakcie. Pri vykonávaní aglutinačnej reakcie so sérami detí v prvých mesiacoch života je z dôvodu funkčnej menejcennosti tvorby protilátok potrebné identifikovať nižšie titre protilátok, čo sa berie do úvahy pri riedení séra. Počiatočné riedenie séra je 1:25. V prvej skúmavke sa získa riedenie 1:50, potom 1:100 atď.
Ak je výsledok reakcie pozitívny, skúmavky ukazujú uviaznuté bunky vo forme zŕn alebo vločiek na pozadí čírej tekutiny. Aglutinát sa postupne usadzuje na dne vo forme „dáždnika“ a kvapalina nad sedimentom sa stáva čírou. Antigénna kontrola je rovnomerne zakalená.
Podľa charakteru sedimentu sa rozlišuje jemno- a hrubozrnná (vločková) aglutinácia. Pri práci s O-sérami sa dosiahne jemnozrnná aglutinácia. Hrubozrnné - keď pohyblivé mikróby interagujú s bičíkovými H-sérami. Vyskytuje sa rýchlejšie ako jemnozrnný a výsledný sediment je veľmi voľný a ľahko sa rozbije.
Intenzita reakcie je vyjadrená takto:
Všetky bunky sa usadili, kvapalina v skúmavke je úplne priehľadná. Výsledok reakcie je ostro pozitívny;
Sedimentov je menej, kvapalina sa úplne nevyčistí. Výsledok reakcie je pozitívny;
Sedimentov je ešte menej, kvapalina je zakalená. Výsledok reakcie je pochybný;
Na dne skúmavky je mierny sediment, kvapalina je zakalená. Pochybný výsledok reakcie;
Neexistuje žiadny sediment, kvapalina je rovnomerne zakalená, ako pri antigénovej kontrole. Výsledok negatívnej reakcie
1.1. AGLUTINAČNÁ REAKCIA (RA)
AGLUTINAČNÁ REAKCIA (RA)
Vďaka svojej špecifickosti, jednoduchosti výkonu a demonštratívnosti sa aglutinačná reakcia rozšírila v mikrobiologickej praxi na diagnostiku mnohých infekčných ochorení.
Aglutinačná reakcia je založená na špecifickosti interakcie protilátok (aglutinínov) s celými mikrobiálnymi alebo inými bunkami (aglutinogény). V dôsledku tejto interakcie vznikajú častice a aglomeráty, ktoré sa zrážajú (aglutinujú) vo forme vločiek.
Aglutinačná reakcia môže zahŕňať živé aj usmrtené baktérie, spirochéty, huby, prvoky, rickettsie, ako aj červené krvinky a iné bunky. Reakcia prebieha v dvoch fázach: prvá (neviditeľná) špecifická, kombinácia antigénu a protilátok, druhá (viditeľná) nešpecifická, zlepenie antigénov, t.j. tvorba aglutinátu.
Aglutinát vzniká, keď sa jedno aktívne centrum divalentnej protilátky spojí s determinantnou skupinou antigénu. Aglutinačná reakcia, ako každá sérologická reakcia, prebieha v prítomnosti elektrolytov.
Navonok má prejav pozitívnej aglutinačnej reakcie dvojaký charakter. V bičíkovitých mikróboch, ktoré majú iba somatický antigén O2, sa samotné mikrobiálne bunky priamo zlepia. Táto aglutinácia sa nazýva jemnozrnná. Vyskytuje sa do 18 22 hodín. v
Bičíkaté mikróby majú dva antigény: somatický O2 antigén a bičíkový H2 antigén. Ak sú bunky zlepené bičíkmi, vytvárajú sa veľké, voľné vločky a táto aglutinačná reakcia sa nazýva hrubozrnná. Vyskytuje sa do 2 4 hodín.
Aglutinačná reakcia sa môže uskutočniť za účelom kvalitatívneho a kvantitatívneho stanovenia špecifických protilátok v krvnom sére pacienta, ako aj za účelom určenia druhu izolovaného patogénu. v
Aglutinačná reakcia sa môže vykonávať ako v rozšírenej verzii, ktorá umožňuje pracovať so sérom nariedeným na diagnostický titer, tak aj vo verzii indikatívnej reakcie, ktorá v zásade umožňuje detegovať špecifické protilátky alebo určiť druh patogén.
Pri vykonávaní podrobnej aglutinačnej reakcie sa na zistenie špecifických protilátok v krvnom sére subjektu odoberá testovacie sérum v riedení 1:50 alebo 1:100. Je to spôsobené tým, že normálne protilátky môžu byť prítomné vo veľmi vysokých koncentráciách v celom alebo mierne zriedenom sére a potom môžu byť výsledky reakcie nepresné. Materiál, ktorý sa testuje v tejto verzii reakcie, je krv pacienta.
Krv sa odoberá nalačno alebo najskôr 6 hodín po jedle (inak môžu byť v krvnom sére kvapôčky tuku, takže je zakalené a nevhodné na výskum). Krvné sérum pacienta sa zvyčajne odoberá v druhom týždni ochorenia sterilným odberom 3 × 4 ml krvi z kubitálnej žily (do tejto doby sa koncentruje maximálne množstvo špecifických protilátok). Ako známy antigén sa používa diagnostické činidlo pripravené z usmrtených, ale nezničených mikrobiálnych buniek špecifického druhu so špecifickou antigénnou štruktúrou.
Pri vykonávaní podrobnej aglutinačnej reakcie s cieľom určiť druh a typ patogénu je antigén živý patogén izolovaný zo študovaného materiálu. Protilátky obsiahnuté v imunodiagnostickom sére sú známe. v
Imunitné diagnostické sérum sa získava z krvi očkovaného králika. Po stanovení titra (maximálne riedenie, pri ktorom sa detegujú protilátky) sa diagnostické sérum naleje do ampuliek s prídavkom konzervačnej látky. Toto sérum sa používa na identifikáciu podľa antigénnej štruktúry izolovaného patogénu.
MOŽNOSTI AGLUTINAČNEJ REAKCIE
Tieto reakcie zahŕňajú antigény vo forme častíc (mikrobiálnych buniek, červených krviniek a iných korpuskulárnych antigénov), ktoré sú navzájom zlepené protilátkami a precipitujú.
Na uskutočnenie aglutinačnej reakcie (RA) sú potrebné tri zložky: 1) antigén (aglutinogén); 2) protilátka (aglutinín) a 3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).
ORIENTATÍVNA (TAŠŤOVÁ) AGLUTINAČNÁ REAKCIA (RA)
Indikatívna alebo doštička RA sa umiestni na podložné sklíčko pri teplote miestnosti. Na tento účel použite Pasteurovu pipetu na samostatné nanesenie kvapky séra v zriedení 1:10 1:20 a kontrolnej kvapky izotonického roztoku chloridu sodného na sklo. Kolónie alebo denná kultúra baktérií (kvapka diagnostica) sa zavedú do oboch bakteriologických slučiek a dôkladne sa premiešajú. Reakcie sa vizuálne zohľadnia po niekoľkých minútach, niekedy pomocou lupy (x5). Pri pozitívnej RA sa zaznamená výskyt veľkých a malých vločiek v kvapke séra, pri negatívnom zostáva sérum rovnomerne zakalené.
NEPRIAMA (PASÍVNA) HEMAGGLUTINAČNÁ REAKCIA (RNGA, RPGA)
Reakcia sa vykonáva: 1) na detekciu polysacharidov, proteínov, extraktov baktérií a iných vysoko disperzných látok, rickettsie a vírusov, ktorých komplexy s aglutinínmi nie je možné vidieť pri konvenčnej RA, alebo 2) na detekciu protilátok v sére pacientov proti tieto vysoko disperzné látky a najmenšie mikroorganizmy.
Nepriama alebo pasívna aglutinácia sa chápe ako reakcia, pri ktorej protilátky interagujú s antigénmi vopred adsorbovanými na inertných časticiach (latex, celulóza, polystyrén, oxid bárnatý a pod. alebo ovčie červené krvinky, ľudská krvná skupina I(0)).
Pri pasívnej hemaglutinačnej reakcii (RPHA) sa ako nosič využívajú červené krvinky. Antigénom nabité červené krvinky sa zlepia v prítomnosti špecifických protilátok proti tomuto antigénu a vyzrážajú sa. Antigénom senzibilizované erytrocyty sa v RPGA používajú ako erytrocytové diagnostické zariadenie na detekciu protilátok (sérodiagnostika). Ak sú červené krvinky nabité protilátkami (erytrocytové protilátky diagnosticum), môže sa použiť na detekciu antigénov.
Inscenácia. V jamkách polystyrénových platní sa pripraví séria sériových riedení séra. Do predposlednej jamky pridajte 0,5 ml zjavne pozitívneho séra a do poslednej jamky 0,5 ml fyziologického roztoku (kontroly). Potom pridajte 0,1 ml zriedeného erytrocytárneho diagnostica do všetkých jamiek, pretrepte a vložte do termostatu na 2 hodiny v
účtovníctvo. V pozitívnom prípade sa červené krvinky usadzujú na dne jamky vo forme rovnomernej vrstvy buniek so zloženým alebo zubatým okrajom (obrátený dáždnik v negatívnom prípade sa usadzujú vo forme gombíka alebo krúžku); .
1.2. NEUTRALIZAČNÁ REAKCIA. LYSIS,
OPSONOFAGOCYTICKÁ REAKCIA, REAKCIA PRECITLIVOSTI
REAKCIA NEUTRALIZÁCIE EXOTOXÍNU ANTITOXÍNOM (RN)
Reakcia je založená na schopnosti antitoxického séra neutralizovať účinok exotoxínu. Používa sa na titráciu antitoxických sér a stanovenie exotoxínu.
Pri titrácii séra sa k rôznym riedeniam antitoxického séra pridá určitá dávka zodpovedajúceho toxínu. Keď je antigén úplne neutralizovaný a neexistujú žiadne nespotrebované protilátky, dochádza k počiatočnej flokulácii. Vločkovacia reakcia sa môže použiť nielen na titráciu séra (napríklad záškrtu), ale aj na titráciu toxínu a toxoidu. Reakcia neutralizácie toxínu s antitoxínom má veľký praktický význam ako metóda na stanovenie aktivity antitoxických terapeutických sér. Antigén v tejto reakcii je skutočný exotoxín.
Sila antitoxického séra je určená konvenčnými jednotkami AE.
1 AE botulotoxínu jeho množstvo neutralizuje 1000 DLM botulotoxínu. Neutralizačná reakcia na určenie druhu alebo typu exotoxínu (na diagnostiku tetanu, botulizmu, záškrtu atď.) sa môže uskutočniť in vitro (podľa Ramona) a pri stanovení toxigenity mikrobiálnych buniek - v géli ( podľa Ouchterlonyho).
Lytická reakcia (RL)
Jednou z ochranných vlastností imunitného séra je jeho schopnosť rozpúšťať mikróby alebo bunkové elementy vstupujúce do tela.
Špecifické protilátky, ktoré spôsobujú rozpustenie buniek (lýzu), sa nazývajú lyzíny. V závislosti od povahy antigénu to môžu byť bakteriolyzíny, cytolyzíny, spirochetolyzíny, hemolyzíny atď.
Lyzíny prejavujú svoj účinok iba v prítomnosti dodatočného komplementového faktora. Komplement, ako faktor nešpecifickej humorálnej imunity, sa nachádza takmer vo všetkých telesných tekutinách, okrem cerebrospinálnej tekutiny a tekutiny prednej komory oka. Pomerne vysoký a konštantný obsah komplementu je zaznamenaný v ľudskom krvnom sére a veľa z neho v krvnom sére morčiat. U iných cicavcov je obsah komplementu v krvnom sére odlišný.
Doplnok je komplexný systém srvátkových bielkovín. Je nestabilný a zrúti sa pri 55 stupňoch na 30 minút. Pri izbovej teplote sa komplement zničí do dvoch hodín. Veľmi citlivý na dlhodobé trasenie, kyseliny a ultrafialové lúče. Komplement sa však dlhodobo (až šesť mesiacov) skladuje v sušenom stave pri nízkych teplotách. Doplnok podporuje lýzu mikrobiálnych buniek a červených krviniek.
Rozlišujú sa reakcie bakteriolýzy a hemolýzy.
Podstatou bakteriolýznej reakcie je, že keď sa špecifické imunitné sérum spojí so zodpovedajúcimi homológnymi živými mikrobiálnymi bunkami v prítomnosti komplementu, dôjde k mikrobiálnej lýze.
Reakcia hemolýzy spočíva v tom, že keď sú erytrocyty vystavené špecifickému séru, ktoré je voči nim imúnne (hemolytické) v prítomnosti komplementu, pozoruje sa rozpúšťanie erytrocytov, t.j. hemolýza.
Hemolytická reakcia v laboratórnej praxi sa používa na stanovenie rozsahu komplementu, ako aj na zohľadnenie výsledkov diagnostických reakcií fixácie komplementu. Titer komplementu je jeho najmenšie množstvo, ktoré spôsobí lýzu červených krviniek do 30 minút v hemolytickom systéme v objeme 2,5 ml. K lýznej reakcii, podobne ako pri všetkých sérologických reakciách, dochádza v prítomnosti elektrolytu.
REAKCIE PRECENITEĽNOSTI (ALERGICKÉ)
Určité formy antigénu môžu pri opakovanom kontakte s telom spôsobiť reakciu, ktorá je špecifická vo svojom základe, ale zahŕňa nešpecifické bunkové a molekulárne faktory akútnej zápalovej reakcie. Sú známe dve formy precitlivenosti: precitlivenosť okamžitého typu (IHT) a precitlivenosť oneskoreného typu (DTH). Prvý typ reakcie nastáva za účasti protilátok a reakcia sa vyvíja najneskôr do 2 hodín po opakovanom kontakte s alergénom. Druhý typ sa realizuje pomocou zápalových T buniek (Tgc) ako hlavných efektorov reakcie, ktoré zabezpečujú akumuláciu makrofágov v oblasti zápalu, reakcia sa prejaví po 6-8 hodinách a neskôr.
Vzniku hypersenzitívnej reakcie predchádza stretnutie s antigénom a vznik senzibilizácie, t.j. objavenie sa protilátok, aktívne senzibilizovaných lymfocytov a pasívne senzibilizovaných cytofilných protilátok iných leukocytov (makrofágy, granulocyty).
Hypersenzitívne reakcie majú tri fázy vývoja: imunologické; patochemické; patofyziologické.
V prvej, špecifickej fáze alergén interaguje s protilátkami a (alebo) senzibilizovanými bunkami. V druhej fáze sa z aktivovaných buniek uvoľňujú biologicky aktívne látky. Uvoľnené mediátory (histamín, serotonín, leukotriény, bradykinín atď.) spôsobujú rôzne periférne účinky charakteristické pre príslušný typ reakcie tretej fázy.
Hypersenzitívne reakcie typu 4
Reakcie tohto typu sú spôsobené patogénnymi medzibunkovými interakciami senzibilizovaných pomocných T-buniek, cytotoxických T-lymfocytov (T-killer cells) a aktivovaných buniek mononukleárneho fagocytového systému, spôsobených dlhotrvajúcou stimuláciou imunitného systému bakteriálnymi antigénmi, v ktorých je prítomný tzv. relatívna nedostatočnosť imunitného systému organizmu eliminovať bakteriálne patogény z vnútorného prostredia infekčné ochorenia. Tieto reakcie z precitlivenosti spôsobujú u pacientov s tuberkulózou tuberkulózne pľúcne dutiny, ich kazeóznu nekrózu a celkovú intoxikáciu. Kožná granulomatóza pri tuberkulóze a lepre z morfopatogenetického hľadiska je z veľkej časti zložená z reakcií precitlivenosti štvrtého typu.
Najznámejším príkladom štvrtého typu hypersenzitívnej reakcie je Mantouxova reakcia, ktorá sa vyvíja v mieste intradermálnej injekcie tuberkulínu pacientovi, ktorého telo a systém sú senzibilizované na mykobakteriálne antigény. V dôsledku reakcie sa vytvorí hustá hyperemická papula s nekrózou v strede, ktorá sa objaví len niekoľko hodín (pomaly) po intradermálnej injekcii tuberkulínu. Tvorba papule začína uvoľnením mononukleárnych fagocytov cirkulujúcej krvi z cievneho riečiska do medzibunkových priestorov. Súčasne začína emigrácia polymorfonukleárnych buniek z cievneho riečiska. Potom infiltrácia neutrofilmi ustúpi a infiltrát sa začne skladať prevažne z lymfocytov a mononukleárnych fagocytov. Tým sa líši od Mantouxovej reakcie od Arthusovej reakcie, pri ktorej sa v mieste lézie hromadia prevažne polymorfonukleárne leukocyty.
Pri hypersenzitívnych reakciách 4. typu vedie dlhodobá stimulácia senzibilizovaných lymfocytov antigénmi v miestach patologických zmien tkaniva k patologicky intenzívnemu a predĺženému uvoľňovaniu cytokínov pomocnými T bunkami. Intenzívne uvoľňovanie cytokínov v miestach poškodenia tkaniva spôsobuje hyperaktiváciu buniek systému mononukleárnych fagocytov, ktoré sa tam nachádzajú, z ktorých mnohé v hyperaktivovanom stave tvoria vlákna epiteloidných buniek a niektoré sa navzájom spájajú a vytvárajú obrovské bunky. Makrofágy, na povrchu ktorých sú vystavené bakteriálne a vírusové antigény, môžu byť zničené fungovaním Tkillerov (prirodzených zabíjačov).
Štvrtý typ hypersenzitívnej reakcie je vyvolaný rozpoznaním cudzieho bakteriálneho antigénu pomocnými T bunkami, ktoré sú naň senzibilizované. Nevyhnutnou podmienkou rozpoznania je interakcia induktorov s antigénmi exponovanými na povrchu buniek prezentujúcich antigén po endocytóze a spracovaní cudzích imunogénov mononukleárnymi fagocytmi. Ďalšou nevyhnutnou podmienkou je expozícia antigénov v kombinácii s molekulami I. triedy z hlavného histokompatibilného komplexu. Po rozpoznaní antigénu senzibilizované pomocné bunky uvoľňujú cytokíny a najmä interleukín2, ktorý aktivuje prirodzené zabíjačské bunky a mononukleárne fagocyty. Aktivované mononukleárne fagocyty uvoľňujú proteolytické enzýmy a voľné kyslíkové radikály, ktoré poškodzujú tkanivo.
Kožné alergické testy sú testy na určenie senzibilizácie tela na alergény, určenie jeho infekcie, napríklad tuberkulózy, brucelózy, úrovne kolektívnej imunity, napríklad na tularémiu. Podľa miesta podania alergénu sa rozlišujú: 1) kožné testy; 2) skarifikácia; 3) intradermálne; 4) subkutánne. Klinická reakcia na alergén počas testu na kožnú alergiu je rozdelená na lokálnu, všeobecnú a fokálnu, ako aj okamžitú a oneskorenú.
Lokálne reakcie mediátorového typu GNT sa vyskytujú po 520 minútach, prejavujú sa vo forme erytému a pľuzgiere, vymiznú po niekoľkých hodinách a sú hodnotené plusovou metódou podľa veľkosti erytému, meranej v mm. Lokálne reakcie HSL sa vyskytujú v priebehu 24 – 48 hodín, trvajú dlho, objavujú sa vo forme infiltrátu, niekedy s nekrózou v strede, a hodnotia sa podľa veľkosti infiltrátu v mm, aj pomocou systému plus. Pri cytotoxických a imunokomplexných typoch HNT sa hyperémia a infiltrácia pozorujú po 3-4 hodinách, maximum dosahujú po 6-8 hodinách a ustupujú približne po dni. Niekedy sa pozorujú kombinované reakcie.
1.3. REAKCIA UPEVŇOVANIA DOPLŇKOV (FFR)
Táto reakcia sa používa v laboratórnych štúdiách na detekciu protilátok v krvnom sére pre rôzne infekcie, ako aj na identifikáciu patogénu podľa jeho antigénnej štruktúry.
Reakcia fixácie komplementu je komplexná sérologická reakcia a je vysoko citlivá a špecifická.
Charakteristickým rysom tejto reakcie je, že zmena antigénu počas jeho interakcie so špecifickými protilátkami nastáva iba v prítomnosti komplementu. Komplement sa adsorbuje iba na komplexe „antigén protilátky“. Komplex „antigén protilátky“ sa vytvorí iba vtedy, ak existuje afinita medzi antigénom a protilátkou v sére.
Adsorpcia komplementu na komplexe „antigénovej protilátky“ môže mať rôzne účinky na osud antigénu v závislosti od jeho charakteristík.
Niektoré z antigénov podliehajú za týchto podmienok prudkým morfologickým zmenám, vrátane rozpustenia (hemolýza, Isaev-Pfeifferov fenomén, cytolytické pôsobenie). Iní menia rýchlosť pohybu (imobilizácia treponému). Iní zomierajú bez náhlych deštruktívnych zmien (baktericídny alebo cytotoxický účinok). Nakoniec, adsorpcia komplementu nemusí byť sprevádzaná zmenami antigénu, ktoré sú ľahko pozorovateľné.
Podľa mechanizmu RSC prebieha v dvoch fázach:
- Prvou fázou je vytvorenie komplexu „antigénových protilátok“ a adsorpcia na tento komplementový komplex. Výsledok fázy nie je vizuálne viditeľný (interakcia antigénu a protilátok s povinnou účasťou komplementu).
- Druhou fázou je zmena antigénu pod vplyvom špecifických protilátok za prítomnosti komplementu. Výsledok fázy môže byť viditeľný vizuálne alebo neviditeľný (detekcia výsledkov reakcie pomocou indikátorového hemolytického systému (ovčie červené krvinky a hemolytické sérum).
K deštrukcii červených krviniek hemolytickým sérom dochádza len vtedy, ak sa do hemolytického systému pridá komplement. Ak bol komplement predtým adsorbovaný na komplex antigén-protilátka, potom nedochádza k hemolýze erytrocytov.
Výsledok experimentu sa hodnotí zaznamenaním prítomnosti alebo neprítomnosti hemolýzy vo všetkých skúmavkách. Reakcia sa považuje za pozitívnu, keď je hemolýza úplne oneskorená, keď je kvapalina v skúmavke bezfarebná a červené krvinky sa usadzujú na dne, negatívna, keď sú červené krvinky úplne lyzované, keď je kvapalina intenzívne sfarbená („lak“ krv). Stupeň oneskorenia hemolýzy sa hodnotí v závislosti od intenzity farby kvapaliny a veľkosti sedimentu červených krviniek na dne (++++, +++, ++, +).
V prípade, že zmeny v antigéne zostávajú neprístupné pre vizuálne pozorovanie, je potrebné použiť druhý systém, ktorý funguje ako indikátor, ktorý umožňuje posúdiť stav komplementu a vyvodiť záver o výsledku reakcie.
Tento indikátorový systém predstavujú zložky hemolytickej reakcie, ktorá zahŕňa ovčie erytrocyty a hemolytické sérum, ktoré obsahuje špecifické protilátky proti erytrocytom (hemolyzíny), ale neobsahuje komplement. Tento indikátorový systém sa pridá do skúmaviek hodinu po umiestnení hlavného RSC. Ak je reakcia fixácie komplementu pozitívna, potom sa vytvorí komplex protilátky a antigénu, ktorý na seba adsorbuje komplement. Keďže komplement sa používa v množstve potrebnom len na jednu reakciu a lýza erytrocytov môže nastať iba v prítomnosti komplementu, potom, keď je adsorbovaný na komplexe „antigénových protilátok“, dôjde k lýze erytrocytov v hemolytickom (indikátorovom) systéme. nenastať. Ak je reakcia fixácie komplementu negatívna, komplex „antigénová protilátka“ sa nevytvorí, komplement zostáva voľný a po pridaní hemolytického systému dochádza k lýze erytrocytov.
1.4. DNA SONDY. POLYMERÁZOVÁ REŤAZOVÁ REAKCIA (PCR),
IMUNOENZÝMOVÁ METÓDA (ELISA), METÓDA S FUNKČNÝMI PROTILÁTKAMI (FFA)
METÓDY GÉNOVÉHO SNÍMANIA
Intenzívny rozvoj molekulárnej biológie a vytvorenie dokonalej metodickej základne pre genetický výskum tvorili základ genetického inžinierstva. V oblasti diagnostiky sa objavil a rýchlo rozvíja smer určovania špecifických nukleotidových sekvencií DNA a RNA, takzvané génové sondovanie. Takéto techniky sú založené na schopnosti nukleových kyselín hybridizovať a vytvárať dvojvláknové štruktúry v dôsledku interakcie komplementárnych nukleotidov (AT, GC).
Na určenie požadovanej sekvencie DNA (alebo RNA) je špeciálne vytvorená takzvaná polynukleotidová sonda so špecifickou sekvenciou báz. Do jeho zloženia sa zavádza špeciálne označenie, ktoré umožňuje identifikovať tvorbu komplexu.
Hoci génové sondovanie nemožno klasifikovať ako metódu imunochemickej analýzy, jej základný princíp (interakcia komplementárnych štruktúr) je metodicky implementovaný rovnakým spôsobom ako indikátorové metódy imunodiagnostiky. Metódy génového sondovania navyše umožňujú doplniť informácie o infekčnom agens v neprítomnosti jeho fenotypovej expresie (vírusy zabudované v genóme, „tiché“ gény).
Na uskutočnenie analýzy DNA sa vzorka denaturuje, aby sa získali jednovláknové štruktúry, s ktorými reagujú molekuly sondy DNA alebo RNA. Na prípravu sond sa používajú buď rôzne úseky DNA (alebo RNA) izolované z prirodzeného zdroja (napríklad konkrétneho mikroorganizmu), zvyčajne prezentované vo forme genetických sekvencií vo vektorových plazmidoch, alebo chemicky syntetizované oligonukleotidy. V niektorých prípadoch sa ako sonda používajú prípravky genómovej DNA hydrolyzované na fragmenty, niekedy prípravky RNA a najmä často ribozomálna RNA. Na označenie sa používajú rovnaké indikátory ako pri rôznych typoch imunochemických analýz: rádioaktívne izotopy, fluoresceíny, biotop (s ďalším vývojom komplexom avidín-enzým) atď.
Poradie analýzy je určené vlastnosťami dostupnej sondy
V súčasnosti sa čoraz viac využívajú komerčné súpravy obsahujúce všetky potrebné zložky.
Vo väčšine prípadov možno postup analýzy rozdeliť do nasledujúcich etáp: príprava vzorky (vrátane extrakcie a denaturácie DNA), fixácia vzorky na nosiči (najčastejšie polymérový membránový filter), prehybridizácia, samotná hybridizácia, premytie nenaviazaných produktov, detekcia . V neprítomnosti štandardného preparátu DNA alebo RNAprobe sa najskôr získa a označí.
Na prípravu vzorky môže byť potrebné predbežne „pestovať“ testovaný materiál na identifikáciu jednotlivých kolónií baktérií alebo zvýšenie koncentrácie vírusov v bunkovej kultúre. Vykonáva sa aj priama analýza vzoriek krvného séra, moču, krviniek alebo plnej krvi na prítomnosť infekčného agens. Na uvoľnenie nukleových kyselín z bunkových štruktúr sa uskutočňuje bunková lýza a v niektorých prípadoch sa prípravok DNA čistí pomocou fenolu.
Pri pôsobení alkálií dochádza k denaturácii DNA, teda k jej prechodu na jednovláknovú formu. Vzorka nukleovej kyseliny sa potom fixuje na nosič, nitrocelulózovú alebo nylonovú membránu, zvyčajne inkubáciou počas 10 minút až 4 hodín pri 80 °C vo vákuu. Ďalej, v procese prehybridizácie sa dosiahne inaktivácia voľných väzbových miest, aby sa znížila nešpecifická interakcia sondy s membránou. Proces hybridizácie trvá od 2 do 20 hodín v závislosti od koncentrácie DNA vo vzorke, koncentrácie použitej sondy a jej veľkosti.
Po dokončení hybridizácie a odmytí nenaviazaných produktov sa deteguje vytvorený komplex. Ak sonda obsahuje rádioaktívnu značku, potom sa na demonštráciu reakcie membrána vystaví fotografickému filmu (autorádiografia). Pre ostatné označenia sa používajú príslušné postupy.
Najperspektívnejšie je získať nerádioaktívne (tzv. studené) sondy. Na rovnakom základe sa vyvíja hybridizačná technika, ktorá umožňuje stanoviť prítomnosť patogénu v preparátoch rezov a tkanivových punkciách, čo je obzvlášť dôležité pri patomorfologickej analýze (hybridizácia in situ).
Významným krokom vo vývoji metód génového sondovania bolo použitie polymerázovej amplifikačnej reakcie (PCR). Tento prístup umožňuje zvýšiť koncentráciu špecifickej (vopred známej) sekvencie DNA vo vzorke syntetizovaním viacerých kópií in vitro. Na uskutočnenie reakcie sa do skúmanej vzorky DNA pridá prípravok enzýmu DNA polymerázy, nadbytok deoxynukleotidov na syntézu a takzvané priméry - dva typy oligonukleotidov s veľkosťou 2025 báz zodpovedajúcich koncovým úsekom DNA. Požadovaná sekvencia DNA. Jeden z primérov by mal byť kópiou začiatku čítacej oblasti kódujúceho reťazca DNA v smere 53 čítania a druhý by mal byť kópiou opačného konca nekódujúceho reťazca. Potom sa s každým cyklom polymerázovej reakcie počet kópií DNA zdvojnásobí.
Aby sa dosiahlo naviazanie primeru, je potrebná denaturácia DNA (topenie) pri 94 °C, po ktorej nasleduje zahriatie zmesi na 40-55 °C.
Na uskutočnenie reakcie boli navrhnuté programovateľné mikrovzorkové inkubátory, aby sa ľahko striedali zmeny optimálnej teploty pre každý stupeň reakcie.
Amplifikačná reakcia môže významne zvýšiť citlivosť analýzy počas génového sondovania, čo je obzvlášť dôležité pri nízkych koncentráciách infekčného agens.
Jednou z významných výhod génového sondovania s amplifikáciou je schopnosť študovať submikroskopické množstvá patologického materiálu.
Ďalšou vlastnosťou metódy, dôležitejšou pre analýzu infekčného materiálu, je schopnosť identifikovať skryté (tiché) gény. Metódy spojené s využívaním génového sondovania budú určite širšie zavedené do praxe diagnostiky infekčných chorôb, keďže budú jednoduchšie a lacnejšie.
Metódy ELISA a RIF majú prevažne kvalitatívny alebo semikvantitatívny charakter. Pri veľmi nízkych koncentráciách zložiek nemožno tvorbu komplexu antigén protilátky detekovať ani vizuálne, ani jednoduchými inštrumentálnymi prostriedkami. Indikácia komplexu antigén-protilátka sa v takýchto prípadoch môže uskutočniť, ak sa do jednej z východiskových zložiek antigén alebo protilátka zavedie značka, ktorá sa dá ľahko detegovať v koncentráciách porovnateľných so stanovenou koncentráciou analytu.
Ako značky sa môžu použiť rádioaktívne izotopy (napríklad 125I), fluorescenčné látky a enzýmy.
V závislosti od použitého označenia existujú rádioimunoanalýza (RIA), fluorescenčná imunita (FIA), enzýmová imunoanalýza (ELISA) atď. vysoká citlivosť, špecifickosť a automatizácia účtovníctva.
Enzýmové imunoanalytické metódy sú skupinou metód, ktoré umožňujú detekciu komplexu antigén-protilátka pomocou substrátu, ktorý je štiepený enzýmom a vytvára farbu.
Podstatou metódy je spojenie zložiek reakcie antigénovej protilátky s nameraným enzýmovým značením. Antigén alebo protilátka, ktorá reaguje, je označená enzýmom. Na základe transformácie substrátu pôsobením enzýmu je možné posúdiť množstvo interagujúcej zložky reakcie antigénovej protilátky. Enzým v tomto prípade slúži ako marker imunitnej reakcie a umožňuje ju pozorovať vizuálne alebo inštrumentálne.
Enzýmy sú veľmi vhodné značky, pretože ich katalytické vlastnosti im umožňujú pôsobiť ako zosilňovače, pretože jedna molekula enzýmu môže podporiť tvorbu viac ako 1 × 105 molekúl produktu katalytickej reakcie za minútu. Je potrebné vybrať enzým, ktorý si dlhodobo zachováva svoju katalytickú aktivitu, nestráca ju pri väzbe na antigén alebo protilátku a má vysokú špecifickosť voči substrátu.
Hlavné metódy produkcie enzýmom značených protilátok alebo antigénov a konjugátov sú: chemické, imunologické a genetické inžinierstvo. Najčastejšie používané enzýmy na ELISA sú chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, galaktozidáza atď.
Na detekciu enzýmovej aktivity v komplexe antigén-protilátka za účelom vizuálneho a inštrumentálneho záznamu reakcie sa používajú chromogénne substráty, ktorých roztoky, spočiatku bezfarebné, počas enzymatickej reakcie získavajú farbu, ktorej intenzita je úmerná množstvu enzýmu. Na detekciu aktivity chrenovej peroxidázy v teste ELISA na pevnej fáze sa teda ako substrát používa kyselina 5-aminosalicylová, ktorá vytvára intenzívne hnedé sfarbenie, a ortofenyléndiamín, ktorý vytvára oranžovo-žlté sfarbenie. Na detekciu aktivity alkalickej fosfatázy a β-galatozidázy sa používajú nitrofenylfosfáty a nitrofenylgalaktozidy.
Výsledok reakcie pri vzniku farebného produktu sa stanoví vizuálne alebo pomocou spektrofotometra, ktorý meria absorpciu svetla s určitou vlnovou dĺžkou.
Existuje veľa možností na vykonanie ELISA. Existujú homogénne a heterogénne možnosti.
Na základe použitej metódy sa rozlišuje medzi kompetitívnymi a nekompetitívnymi metódami ELISA. Ak je v prvom štádiu v systéme prítomná len analyzovaná zlúčenina a jej zodpovedajúce väzbové centrá (antigén a špecifické protilátky), potom je metóda nekompetitívna. Ak je v prvej fáze prítomná analyzovaná zlúčenina (antigén) a jej analóg (enzýmom značený antigén), ktoré si navzájom konkurujú o väzbu na špecifické väzbové centrá (protilátky), ktorých je nedostatok, potom je metóda kompetitívna. V tomto prípade platí, že čím viac testovaného antigénu roztok obsahuje, tým menší je počet naviazaných značených antigénov.
METÓDA FLUORESCENČNÝCH PROTILÁTOK (MFA) alebo IMUNOFLUORESCENČNÁ REAKCIA (RIF)
Imunofluorescenčná metóda je metódou voľby na rýchlu detekciu a identifikáciu neznámeho mikroorganizmu v testovanom materiáli.
Ag + AT + elektrolyt = komplex žiariaci v UV lúčoch
Mikróbové sérum označené fluorochrómom
Často používaným farbivom je fluoresceín izotiokyanát FITC
Pri štúdiu tejto metódy sa používa fluorescenčný mikroskop.
Inscenácia RIF
Na náter sa aplikuje 30 μl roztoku protilátky značenej FITC.
Pohár umiestnite do vlhkej komory a držte ho pri izbovej teplote 20-25 minút, alebo 15 minút v termostate pri 37°C.
Pohár umývajte pod tečúcou vodou z vodovodu po dobu 2 minút, opláchnite destilovanou vodou a vysušte na vzduchu.
Na vysušený náter sa nanesie kvapka montážnej kvapaliny, náter sa prekryje krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pomocou fluorescenčného mikroskopu alebo fluorescenčného nástavca na bežný optický mikroskop.
Č. 29 Aglutinačná reakcia. Komponenty, mechanizmus, spôsoby inštalácie. Aplikácia.
Aglutinačná reakcia- jednoduchá reakcia, pri ktorej protilátky viažu korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty alebo iné bunky, nerozpustné častice s adsorbovanými antigénmi, ako aj makromolekulové agregáty). Vyskytuje sa v prítomnosti elektrolytov, napríklad keď sa pridá izotonický roztok chloridu sodného.
Používajú sa rôzne varianty aglutinačnej reakcie: extenzívna, indikatívna, nepriama atď. Aglutinačná reakcia sa prejavuje tvorbou vločiek alebo sedimentu (bunky „zlepené“ protilátkami s dvomi alebo viacerými centrami viažucimi antigén - obr. 13.1). RA sa používa na:
1) stanovenie protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakcia), týfusom a paratýfusom (Vidalova reakcia) a inými infekčnými chorobami;
2) určenie patogénu izolovaný od pacienta;
3) stanovenie krvných skupín pomocou monoklonálnych protilátok proti aloantigénom erytrocytov.
Na stanovenie protilátok u pacienta vykonajte podrobnú aglutinačnú reakciu: Diagnosticum (suspenzia usmrtených mikróbov) sa pridá k riedeniam pacientovho krvného séra a po niekoľkých hodinách inkubácie pri 37 °C sa zaznamená najvyššie riedenie séra (sérový titer), pri ktorom došlo k aglutinácii, t. j. zrazenine. tvorené.
Povaha a rýchlosť aglutinácie závisí od typu antigénu a protilátok. Príkladom sú zvláštnosti interakcie diagnostika (O- a H-antigénov) so špecifickými protilátkami. Aglutinačná reakcia s O-diagnosticum (baktérie usmrtené teplom, zadržiavajúce termostabilný O-antigén) prebieha vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formaldehydom, zadržiavajúce termolabilný bičíkový H-antigén) je hrubá a prebieha rýchlejšie. Ak je potrebné určiť patogén izolovaný od pacienta, dajte indikatívna aglutinačná reakcia, pomocou diagnostických protilátok (aglutinačné sérum), t.j. vykonáva sa sérotypizácia patogénu. Indikatívna reakcia sa uskutočňuje na podložnom sklíčku. Čistá kultúra patogénu izolovaná od pacienta sa pridá do kvapky diagnostického aglutinačného séra v riedení 1:10 alebo 1:20. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Keď sa v kvapke so sérom a mikróbmi objaví vločkovitý sediment, vykoná sa podrobná aglutinačná reakcia v skúmavkách so zvyšujúcimi sa riedeniami aglutinačného séra, do ktorej sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu. Aglutinácia sa berie do úvahy podľa množstva sedimentu a stupňa čírosti kvapaliny. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak sa aglutinácia pozoruje v zriedení blízkom titru diagnostického séra. Súčasne sa berú do úvahy kontroly: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.
Rôzne príbuzné baktérie môžu byť aglutinované rovnakým diagnostickým aglutinačným sérom, ktoré
sťažuje ich identifikáciu. Preto používajú adsorbované aglutinačné séra, z ktorých
krížovo reagujúce protilátky adsorpciou na príbuzné baktérie. Protilátky sú v takýchto sérach zachované,
špecifické len pre danú baktériu.
