Méthodes de recherche virologique— les méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. En virologie, les méthodes de biologie moléculaire sont largement utilisées, à l'aide desquelles il a été possible d'établir la structure moléculaire des particules virales, les méthodes de leur pénétration dans la cellule et les caractéristiques de la reproduction virale, la structure primaire des acides nucléiques et des protéines viraux. Des méthodes sont en cours de développement pour déterminer la séquence des éléments constitutifs des acides nucléiques viraux et des acides aminés protéiques. Il devient possible de lier les fonctions des acides nucléiques et des protéines qu'ils codent avec la séquence nucléotidique et d'établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans la pathogenèse de l'infection virale.
Les méthodes de recherche virologique reposent également sur les processus immunologiques (interaction de l'antigène avec les anticorps), les propriétés biologiques du virus (capacité d'hémagglutination, d'hémolyse, activité enzymatique), les caractéristiques de l'interaction du virus avec la cellule hôte (nature de l'effet cytopathique , formation d'inclusions intracellulaires, etc.) .
Dans le diagnostic des infections virales, dans la culture, l'isolement et l'identification des virus, ainsi que dans la production de préparations vaccinales, la méthode de culture tissulaire et cellulaire est largement utilisée. Des cultures cellulaires primaires, secondaires, stables, continues et diploïdes sont utilisées. Les cultures primaires sont obtenues en dispersant les tissus avec des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase). La source de cellules peut être des tissus et des organes (généralement des reins) d'embryons humains et animaux. Une suspension de cellules dans un milieu nutritif est placée dans ce qu'on appelle des matelas, des bouteilles ou des boîtes de Petri, où, après s'être fixées à la surface du récipient, les cellules commencent à se multiplier. Pour l'infection virale, une monocouche cellulaire est généralement utilisée. Le liquide nutritif est drainé, la suspension virale est ajoutée dans certaines dilutions et après contact avec les cellules, un milieu nutritif frais, généralement sans sérum, est ajouté.
Les cellules de la plupart des cultures primaires peuvent être repiquées ; une telle culture est appelée culture secondaire. Avec le passage ultérieur des cellules, une population de cellules de type fibroblaste se forme, capables de se reproduire rapidement, dont la plupart conservent l'ensemble original de chromosomes. Ce sont des cellules dites diploïdes. En cultivant des cellules en série, des cultures cellulaires continues et stables sont obtenues. Au cours des passages, des cellules homogènes à division rapide avec un ensemble hétéroploïde de chromosomes apparaissent. Les lignées cellulaires stables peuvent être monocouches ou en suspension. Les cultures monocouches se développent sous la forme d'une couche continue sur la surface du verre, tandis que les cultures en suspension se développent sous la forme de suspensions dans divers récipients utilisant des dispositifs de mélange. Il existe plus de 400 lignées cellulaires dérivées de 40 espèces animales différentes (dont les primates, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens, les poissons, les insectes) et les humains.
Des morceaux d’organes et de tissus individuels (cultures d’organes) peuvent être cultivés dans des milieux nutritifs artificiels. Ces types de cultures préservent la structure tissulaire, ce qui est particulièrement important pour l’isolement et le passage des virus qui ne se reproduisent pas dans des cultures de tissus indifférenciés (par exemple les coronavirus).
Dans les cultures cellulaires infectées, les virus peuvent être détectés par des modifications de la morphologie cellulaire, des effets cytopathiques qui peuvent être spécifiques, l'apparition d'inclusions, par le dosage des antigènes viraux dans la cellule et dans le liquide de culture ; établir les propriétés biologiques de la descendance virale dans un liquide de culture et titrer les virus dans des cultures tissulaires, des embryons de poulet ou des animaux sensibles ; en identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans des cellules par hybridation moléculaire ou accumulations d'acides nucléiques par la méthode cytochimique utilisant la microscopie à fluorescence.
L’isolement des virus est un processus long et laborieux. Elle est réalisée pour déterminer le type ou le variant du virus circulant dans la population (par exemple, pour identifier un sérovariant du virus de la grippe, une souche sauvage ou vaccinale du virus de la polio, etc.) ; dans les cas où il est nécessaire de prendre des mesures épidémiologiques urgentes ; lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent ; si nécessaire, confirmer le diagnostic préliminaire ; pour l'indication de virus dans les objets environnementaux. Lors de l'isolement des virus, la possibilité de leur persistance dans le corps humain, ainsi que l'apparition d'une infection mixte causée par deux ou plusieurs virus, est prise en compte. Une population génétiquement homogène du virus obtenue à partir d'un virion est appelée clone viral, et le processus d'obtention est appelé clonage.
Pour isoler les virus, on utilise l'infection d'animaux de laboratoire sensibles et d'embryons de poulet, mais le plus souvent, la culture tissulaire est utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symplastes et de syncytia, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par immunofluorescence, hémadsorption, hémagglutination (pour les virus hémagglutinants), etc. . Ces signes ne peuvent être détectés qu’après 2-3 passages du virus.
Les embryons de poulet sont utilisés pour isoler un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, et des souris nouveau-nées sont utilisées pour isoler certains virus Coxsackie et un certain nombre d'arbovirus. L'identification des virus isolés est réalisée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes.
Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans une culture tissulaire, déterminant la dilution la plus élevée du liquide contenant le virus à laquelle se produit la dégénérescence tissulaire, les inclusions et les antigènes spécifiques du virus se forment. La méthode des plages peut être utilisée pour titrer un certain nombre de virus. Les plaques, ou colonies négatives de virus, sont des foyers de cellules détruites par le virus dans une culture tissulaire monocouche sous une couche de gélose. Le comptage des colonies permet une analyse quantitative de l’activité infectieuse des virus en partant du principe qu’une particule virale infectieuse forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants intravitales, généralement du rouge neutre ; les plaques n'adsorbent pas le colorant et sont donc visibles sous forme de taches lumineuses sur le fond des cellules vivantes colorées. Le titre du virus est exprimé en nombre d'unités formant des plages pour 1 ml.
La purification et la concentration des virus sont généralement réalisées par ultracentrifugation différentielle suivie d'une centrifugation par concentration ou par gradient de densité. Pour purifier les virus, des méthodes immunologiques, la chromatographie par échange d'ions, des immunosorbants, etc. sont utilisés.
Le diagnostic en laboratoire des infections virales comprend la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériel clinique ; isoler le virus de ce matériel ; sérodiagnostic. Le choix de la méthode de diagnostic en laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la durée de la maladie et des capacités du laboratoire. Le diagnostic moderne des infections virales repose sur des méthodes expresses qui permettent d'obtenir une réponse plusieurs heures après le prélèvement du matériel clinique dans les premiers stades de la maladie. Il s'agit notamment de la microscopie électronique et immunitaire, ainsi que de l'immunofluorescence, la méthode d'hybridation moléculaire. , détection d'anticorps de la classe IgM, etc.
La microscopie électronique des virus colorés négativement permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic des infections virales est limitée aux cas où la concentration de particules virales dans le matériel clinique est assez élevée (10 5 sur 1). ml et plus haut). L’inconvénient de cette méthode est l’incapacité de distinguer les virus appartenant au même groupe taxonomique. Cette déficience est surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie électronique immunitaire. La méthode repose sur la formation de complexes immuns en ajoutant du sérum spécifique aux particules virales, tout en concentrant simultanément les particules virales, permettant leur identification. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. À des fins de diagnostic express, un examen au microscope électronique des extraits de tissus, des matières fécales, du liquide des vésicules et des sécrétions du nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus ; ses capacités sont élargies grâce à l’utilisation d’anticorps marqués.
La méthode d'hybridation moléculaire, basée sur la détection d'acides nucléiques spécifiques du virus, permet de détecter des copies uniques de gènes et n'a pas d'égale en sensibilité. La réaction repose sur l’hybridation de brins d’ADN ou d’ARN complémentaires (sondes) et la formation de structures double brin. La sonde la moins chère est l’ADN recombinant cloné. La sonde est marquée avec des précurseurs radioactifs (généralement du phosphore radioactif). L'utilisation de réactions colorimétriques est prometteuse. Il existe plusieurs options d'hybridation moléculaire : hybridation ponctuelle, hybridation par blot, hybridation sandwich, hybridation in situ, etc.
Les anticorps de la classe IgM apparaissent plus tôt que les anticorps de la classe G (du 3ème au 5ème jour de la maladie) et disparaissent au bout de quelques semaines, leur détection indique donc une infection récente. Les anticorps de la classe lgM sont détectés par immunofluorescence ou par dosage immunoenzymatique à l'aide d'antisérums anti-m (sérums contre les chaînes lourdes des lgM).
Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir. Méthodes de recherche immunologique ): réactions de fixation du complément, inhibition de l'hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, dosage immunoenzymatique, dosage radioimmunologique. Des microméthodes pour de nombreuses réactions ont été développées et leurs techniques sont constamment améliorées. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et pour le sérodiagnostic afin de déterminer l'augmentation des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (le premier sérum est prélevé dans les premiers jours après la maladie, le second - après 2- 3 semaines). Une valeur diagnostique n'est pas inférieure à une multiplication par quatre des anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection d'anticorps de la classe IgM indique une infection récente, alors les anticorps de la classe IgC persistent plusieurs années, et parfois toute la vie.
Pour identifier les antigènes individuels des virus et leurs anticorps dans des mélanges complexes sans purification préalable des protéines, l'immunotransfert est utilisé. La méthode combine le fractionnement des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec une immuno-indication ultérieure des protéines à l'aide de la méthode de dosage immunoenzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de pureté chimique de l'antigène et permet d'identifier des paires antigène-anticorps individuelles. Cette tâche est pertinente, par exemple, dans le sérodiagnostic de l'infection par le VIH, où les réactions faussement positives du test immuno-enzymatique sont causées par la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes cellulaires, qui sont présents en raison d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification des anticorps dans les sérums des patients contre les antigènes viraux internes et externes permet de déterminer le stade de la maladie, et lors de l'analyse des populations, la variabilité des protéines virales. L'immunotransfert pour l'infection par le VIH est utilisé comme test de confirmation pour identifier les antigènes viraux individuels et les anticorps dirigés contre eux. Lors de l’analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. Le grand intérêt de la méthode réside dans la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie de l'ADN recombinant, en établissant leurs tailles et la présence de déterminants antigéniques.
Méthodes de recherche virologique- les méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. En virologie, les méthodes de biologie moléculaire sont largement utilisées, à l'aide desquelles il a été possible d'établir la structure moléculaire des particules virales, les méthodes de leur pénétration dans la cellule et les caractéristiques de la reproduction virale, la structure primaire des acides nucléiques et des protéines viraux. Des méthodes sont en cours de développement pour déterminer la séquence des éléments constitutifs des acides nucléiques viraux et des acides aminés protéiques. Il devient possible de lier les fonctions des acides nucléiques et des protéines qu'ils codent avec la séquence nucléotidique et d'établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans l'infection virale.
Les méthodes de recherche virologique reposent également sur les processus immunologiques (interaction de l'antigène avec les anticorps), les propriétés biologiques du virus (capacité d'hémagglutination, d'hémolyse, activité enzymatique), les caractéristiques de l'interaction du virus avec la cellule hôte (nature de l'effet cytopathique , formation d'inclusions intracellulaires, etc.) .
Dans le diagnostic des infections virales, dans la culture, l'isolement et l'identification des virus, ainsi que dans la production de préparations vaccinales, la méthode de culture tissulaire et cellulaire est largement utilisée. Des cultures cellulaires primaires, secondaires, stables, continues et diploïdes sont utilisées. Les cultures primaires sont obtenues en dispersant les tissus avec des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase). La source de cellules peut être des tissus et des organes (généralement des reins) d'embryons humains et animaux. Une suspension de cellules dans un milieu nutritif est placée dans ce qu'on appelle des matelas, des bouteilles ou des boîtes de Petri, où, après s'être fixées à la surface du récipient, les cellules commencent à se multiplier. Pour l'infection virale, une monocouche cellulaire est généralement utilisée. Le liquide nutritif est drainé, la suspension virale est ajoutée dans certaines dilutions et après contact avec les cellules, un milieu nutritif frais, généralement sans sérum, est ajouté.
Les cellules de la plupart des cultures primaires peuvent être repiquées ; une telle culture est appelée culture secondaire. Avec le passage ultérieur des cellules, une population de cellules de type fibroblaste se forme, capables de se reproduire rapidement, dont la plupart conservent l'ensemble original de chromosomes. Ce sont des cellules dites diploïdes. En cultivant des cellules en série, des cultures cellulaires continues et stables sont obtenues. Au cours des passages, des cellules homogènes à division rapide avec un ensemble hétéroploïde de chromosomes apparaissent. Les lignées cellulaires stables peuvent être monocouches ou en suspension. Les cultures monocouches se développent sous la forme d'une couche continue sur la surface du verre, tandis que les cultures en suspension se développent sous la forme de suspensions dans divers récipients utilisant des dispositifs de mélange. Il existe plus de 400 lignées cellulaires dérivées de 40 espèces animales différentes (dont les primates, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens, les poissons, les insectes) et les humains.
Des morceaux d’organes et de tissus individuels (cultures d’organes) peuvent être cultivés dans des milieux nutritifs artificiels. Ces types de cultures préservent la structure tissulaire, ce qui est particulièrement important pour l’isolement et le passage des virus qui ne se reproduisent pas dans des cultures de tissus indifférenciés (par exemple les coronavirus).
Dans les cultures cellulaires infectées, les virus peuvent être détectés par des modifications de la morphologie cellulaire, des effets cytopathiques qui peuvent être spécifiques, l'apparition d'inclusions, par le dosage des antigènes viraux dans la cellule et dans le liquide de culture ; établir les propriétés biologiques de la descendance virale dans un liquide de culture et titrer les virus dans des cultures tissulaires, des embryons de poulet ou des animaux sensibles ; en identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans des cellules par hybridation moléculaire ou accumulations d'acides nucléiques par la méthode cytochimique utilisant la microscopie à fluorescence.
L’isolement des virus est un processus long et laborieux. Elle est réalisée pour déterminer le type ou le variant du virus circulant dans la population (par exemple, pour identifier un sérovariant du virus a, une souche sauvage ou vaccinale du virus a, etc.) ; dans les cas où il est nécessaire de prendre des mesures épidémiologiques urgentes ; lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent ; si nécessaire, confirmer le diagnostic préliminaire ; pour l'indication de virus dans les objets environnementaux. Lors de l'isolement des virus, la possibilité de leur persistance dans le corps humain, ainsi que l'apparition d'une infection mixte causée par deux ou plusieurs virus, est prise en compte. Une population génétiquement homogène du virus obtenue à partir d'un virion est appelée clone viral, et le processus d'obtention est appelé clonage.
Pour isoler les virus, on utilise l'infection d'animaux de laboratoire sensibles et d'embryons de poulet, mais le plus souvent, la culture tissulaire est utilisée. La présence du virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique),
la formation de symplastes et de syncytia, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi que d'antigènes spécifiques détectés par les méthodes d'immunofluorescence, d'hémadsorption, d'hémagglutination (pour les virus hémagglutinants), etc. Ces signes ne peuvent être détectés qu’après 2-3 passages du virus.Pour isoler un certain nombre de virus, par exemple les virus a, on utilise des embryons de poulet, pour isoler certains virus Coxsackie et un certain nombre d'arbovirus - des souris nouveau-nées. L'identification des virus isolés est réalisée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes.
Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans une culture tissulaire, déterminant la dilution la plus élevée du liquide contenant le virus à laquelle se produit la dégénérescence tissulaire, les inclusions et les antigènes spécifiques du virus se forment. La méthode des plages peut être utilisée pour titrer un certain nombre de virus. Les plaques, ou colonies négatives de virus, sont des foyers de cellules détruites par le virus dans une culture tissulaire monocouche sous une couche de gélose. Le comptage des colonies permet une analyse quantitative de l’activité infectieuse des virus en partant du principe qu’une particule virale infectieuse forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants intravitales, généralement du rouge neutre ; les plaques n'adsorbent pas le colorant et sont donc visibles sous forme de taches lumineuses sur le fond des cellules vivantes colorées. Le titre du virus est exprimé en nombre d'unités formant des plages pour 1 ml.
La purification et la concentration des virus sont généralement réalisées par ultracentrifugation différentielle suivie d'une centrifugation par concentration ou par gradient de densité. Pour purifier les virus, des méthodes immunologiques, la chromatographie par échange d'ions, des immunosorbants, etc. sont utilisés.
Le diagnostic en laboratoire des infections virales comprend la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériel clinique ; isoler le virus de ce matériel ; sérodiagnostic. Le choix de la méthode de diagnostic en laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la durée de la maladie et des capacités du laboratoire. Le diagnostic moderne des infections virales repose sur des méthodes expresses qui permettent d'obtenir une réponse plusieurs heures après le prélèvement du matériel clinique dans les premiers stades de la maladie. Il s'agit notamment de la microscopie électronique et immunitaire,
ainsi que l'immunofluorescence, la méthode d'hybridation moléculaire, la détection d'anticorps de classe IgG, etc.La microscopie électronique des virus colorés négativement permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic des infections virales est limitée aux cas où la concentration de particules virales dans le matériel clinique est assez élevée (10 5 sur 1). ml et plus haut). L’inconvénient de cette méthode est l’incapacité de distinguer les virus appartenant au même groupe taxonomique. Cette déficience est surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie électronique immunitaire. La méthode repose sur la formation de complexes immuns en ajoutant du sérum spécifique aux particules virales, tout en concentrant simultanément les particules virales, permettant leur identification. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. À des fins de diagnostic express, un examen au microscope électronique des extraits de tissus, des matières fécales, du liquide des vésicules et des sécrétions du nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus ; ses capacités sont élargies grâce à l’utilisation d’anticorps marqués.
La méthode d'hybridation moléculaire, basée sur la détection d'acides nucléiques spécifiques du virus, permet de détecter des copies uniques de gènes et n'a pas d'égale en sensibilité. La réaction repose sur l’hybridation de brins d’ADN ou d’ARN complémentaires (sondes) et la formation de structures double brin. La sonde la moins chère est l’ADN recombinant cloné. La sonde est marquée avec des précurseurs radioactifs (généralement du phosphore radioactif). L'utilisation de réactions colorimétriques est prometteuse. Il existe plusieurs options d'hybridation moléculaire : hybridation ponctuelle, hybridation par blot, hybridation sandwich, hybridation in situ, etc.
Les anticorps de la classe IgM apparaissent plus tôt que les anticorps de la classe G (du 3ème au 5ème jour de la maladie) et disparaissent au bout de quelques semaines, leur détection indique donc une infection récente. Les anticorps de la classe lgM sont détectés par immunofluorescence ou par dosage immunoenzymatique à l'aide d'antisérums anti-m (sérums contre les chaînes lourdes des lgM).
Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir. Méthodes de recherche immunologique ): compléter les réactions de fixation,
inhibition de l'hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, dosage immunoenzymatique, dosage radioimmunologique. Des microméthodes pour de nombreuses réactions ont été développées et leurs techniques sont constamment améliorées. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et pour le sérodiagnostic afin de déterminer l'augmentation des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (le premier sérum est prélevé dans les premiers jours après la maladie, le second - après 2- 3 semaines). Une valeur diagnostique n'est pas inférieure à une multiplication par quatre des anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection d'anticorps de la classe IgM indique une infection récente, alors les anticorps de la classe IgC persistent plusieurs années, et parfois toute la vie.Pour identifier les antigènes individuels des virus et leurs anticorps dans des mélanges complexes sans purification préalable des protéines, l'immunotransfert est utilisé. La méthode combine le fractionnement des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec une immuno-indication ultérieure des protéines à l'aide de la méthode de dosage immunoenzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de pureté chimique de l'antigène et permet d'identifier des paires antigène-anticorps individuelles. Cette tâche est pertinente, par exemple, dans le sérodiagnostic de l'infection par le VIH, où les réactions faussement positives du test immuno-enzymatique sont causées par la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes cellulaires, qui sont présents en raison d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification des anticorps dans les sérums des patients contre les antigènes viraux internes et externes permet de déterminer le stade de la maladie, et lors de l'analyse des populations, la variabilité des protéines virales. L'immunotransfert pour l'infection par le VIH est utilisé comme test de confirmation pour identifier les antigènes viraux individuels et les anticorps dirigés contre eux. Lors de l’analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. Le grand intérêt de la méthode réside dans la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie de l'ADN recombinant, en établissant leurs tailles et la présence de déterminants antigéniques.
Bibliographie: Boukrinskaïa A.G. Virologie, M., 1986 ; Virologie, Méthodes, éd. B. Meikhi, trad. de l'anglais, M., 1988 ; Manuel de méthodes de recherche microbiologique et virologique, éd. M.O. Birgera, M., 1982.
Méthodes de recherche virologique méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. En virologie, les méthodes de biologie moléculaire sont largement utilisées, à l'aide desquelles il a été possible d'établir la structure moléculaire des particules virales, les méthodes de leur pénétration dans la cellule et les caractéristiques de la reproduction virale, la structure primaire des acides nucléiques et des protéines viraux. Des méthodes sont en cours de développement pour déterminer la séquence des éléments constitutifs des acides nucléiques viraux et des acides aminés protéiques. Il devient possible de lier les fonctions des acides nucléiques et des protéines qu'ils codent avec la séquence nucléotidique et d'établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans la pathogenèse de l'infection virale. Dans les cultures cellulaires infectées, on peut détecter des changements dans la morphologie cellulaire, des effets cytopathiques, qui peuvent être de nature spécifique, l'apparition d'inclusions, par la détermination d'antigènes viraux dans la cellule et dans le liquide de culture ; établir les propriétés biologiques de la descendance virale dans un liquide de culture et titrer les virus dans des cultures tissulaires, des embryons de poulet ou des animaux sensibles ; en identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans des cellules par hybridation moléculaire ou accumulations d'acides nucléiques par la méthode cytochimique utilisant la microscopie à fluorescence. L’isolement des virus est un processus long et laborieux. Elle est réalisée pour déterminer le type ou le variant du virus circulant dans la population (par exemple, pour identifier un sérovariant du virus de la grippe, une souche sauvage ou vaccinale du virus de la polio, etc.) ; dans les cas où il est nécessaire de prendre des mesures épidémiologiques urgentes ; lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent ; si nécessaire, confirmer le diagnostic préliminaire ; pour l'indication de virus dans les objets environnementaux. Lors de l'isolement des virus, la possibilité de leur persistance dans le corps humain, ainsi que l'apparition d'une infection mixte causée par deux ou plusieurs virus, est prise en compte. Une population génétiquement homogène du virus obtenue à partir d'un virion est appelée clone viral, et le processus d'obtention est appelé clonage. Pour isoler les virus, des animaux de laboratoire sensibles et des embryons de poulet sont utilisés, mais la culture tissulaire est le plus souvent utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symplastes et de syncytia, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par immunofluorescence, hémadsorption, hémagglutination (pour les virus hémagglutinants), etc. . Ces signes ne peuvent être détectés qu’après 2-3 passages du virus. Pour isoler un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, des embryons de poulet sont utilisés, et pour isoler certains virus Coxsackie et un certain nombre d'arbovirus, des souris nouveau-nées sont utilisées. L'identification des virus isolés est réalisée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes. Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans une culture tissulaire, déterminant la dilution la plus élevée du liquide contenant le virus à laquelle les tissus se forment et ceux spécifiques au virus se forment. La méthode des plages peut être utilisée pour titrer un certain nombre de virus. Les plaques, ou colonies négatives de virus, sont des foyers de cellules détruites par le virus dans une culture tissulaire monocouche sous une couche de gélose. Le comptage des colonies permet de quantifier l’activité infectieuse des virus en partant du principe qu’une particule virale infectieuse forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants intravitales, généralement du rouge neutre ; les plaques n'adsorbent pas le colorant et sont donc visibles sous forme de taches lumineuses sur le fond des cellules vivantes colorées. exprimé en nombre d'unités formant des plaques dans 1 ml. La purification et la concentration des virus sont généralement réalisées par ultracentrifugation différentielle suivie d'une centrifugation par concentration ou par gradient de densité. Pour purifier les virus, des méthodes immunologiques, la chromatographie par échange d'ions, des immunosorbants, etc. sont utilisés. Le diagnostic en laboratoire des infections virales comprend la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériel clinique ; virus provenant de ce matériel ; sérodiagnostic. Le choix de la méthode de diagnostic en laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la durée de la maladie et des capacités du laboratoire. Les infections virales modernes reposent sur des méthodes expresses qui permettent d'obtenir une réponse plusieurs heures après le prélèvement du matériel clinique dans les premiers stades de la maladie. Il s'agit notamment de l'électron et de l'électron immunitaire, ainsi que de la méthode d'hybridation moléculaire et de détection des anticorps. la classe IgM, etc. La microscopie électronique des virus colorés négativement permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic des infections virales est limitée aux cas où le nombre de particules virales dans le matériel clinique est assez élevé (10 5 sur 1). ml et plus haut). L’inconvénient de cette méthode est l’incapacité de distinguer les virus appartenant au même groupe taxonomique. Cette déficience est surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie électronique immunitaire. La méthode repose sur la formation de complexes immuns en ajoutant du sérum spécifique aux particules virales, tout en concentrant simultanément les particules virales, permettant leur identification. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. À des fins de diagnostic express, un examen au microscope électronique des extraits de tissus, des matières fécales, des liquides et des sécrétions du nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus ; ses capacités sont élargies grâce à l’utilisation d’anticorps marqués. La méthode d'hybridation moléculaire, basée sur la détection d'acides nucléiques spécifiques du virus, permet de détecter des copies uniques de gènes et n'a pas d'égale en sensibilité. repose sur l'hybridation de brins complémentaires ou d'ARN (sondes) et la formation de structures double brin. La sonde la moins chère est l’ADN recombinant cloné. marqués avec des précurseurs radioactifs (généralement du phosphore radioactif). L'utilisation de réactions colorimétriques est prometteuse. Il existe plusieurs options d'hybridation moléculaire : hybridation ponctuelle, hybridation par blot, hybridation sandwich, in situ, etc. Les anticorps de la classe IgM apparaissent plus tôt que la classe G (du 3ème au 5ème jour de la maladie) et disparaissent au bout de quelques semaines, leur détection indique donc une infection récente. Les anticorps de la classe lgM sont détectés par immunofluorescence ou par dosage immunoenzymatique à l'aide d'antisérums anti-μ (sérums contre les chaînes lourdes de lgM). Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir Méthodes de recherche immunologique) :
réactions de fixation du complément, inhibition de l'hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, dosage immunoenzymatique, dosage radioimmunologique. Des microméthodes pour de nombreuses réactions ont été développées et leurs techniques sont constamment améliorées. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et pour le sérodiagnostic afin de déterminer l'augmentation des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (le premier sérum est prélevé dans les premiers jours après la maladie, le second - après 2- 3 semaines). Une valeur diagnostique n'est pas inférieure à une multiplication par quatre des anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection d'anticorps de la classe IgM indique une infection récente, alors les anticorps de la classe IgC persistent plusieurs années, et parfois toute la vie. Pour identifier les antigènes individuels des virus et leurs anticorps dans des mélanges complexes sans purification préalable des protéines, l'immunotransfert est utilisé. La méthode combine le fractionnement des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec une immuno-indication ultérieure des protéines à l'aide de la méthode de dosage immunoenzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences en matière de pureté chimique de l'antigène et permet d'identifier des paires d'anticorps individuelles. Cette tâche est pertinente, par exemple, dans le sérodiagnostic de l'infection par le VIH, où les réactions faussement positives du test immuno-enzymatique sont causées par la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes cellulaires, qui sont présents en raison d'une purification insuffisante des protéines virales. les anticorps dans le sérum des patients contre les antigènes viraux internes et externes permettent de déterminer le stade de la maladie et lors de l'analyse des populations - les protéines virales. L'immunotransfert pour l'infection par le VIH est utilisé comme test de confirmation pour identifier les antigènes viraux individuels et les anticorps dirigés contre eux. Lors de l’analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. Le grand intérêt de la méthode réside dans la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie de l'ADN recombinant, en établissant leurs tailles et la présence de déterminants antigéniques. Bibliographie: Boukrinskaïa A.G. , M., 1986 ; Virologie, Méthodes, éd. B. Meikhi, . de l'anglais, M., 1988 ; Manuel de méthodes de recherche microbiologique et virologique, éd. M.O. Birgera, M., 1982.
1. Petite encyclopédie médicale. - M. : Encyclopédie médicale. 1991-96 2. Premiers secours. - M. : Grande Encyclopédie russe. 1994 3. Dictionnaire encyclopédique des termes médicaux. - M. : Encyclopédie soviétique. - 1982-1984.
Voyez ce que sont les « Méthodes de recherche virologique » dans d'autres dictionnaires :
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Méthodes de recherche virologique
méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. En virologie, les méthodes de biologie moléculaire sont largement utilisées, à l'aide desquelles il a été possible d'établir la structure moléculaire des particules virales, les méthodes de leur pénétration dans la cellule et les caractéristiques de la reproduction virale, la structure primaire des acides nucléiques et des protéines viraux. Des méthodes sont en cours de développement pour déterminer la séquence des éléments constitutifs des acides nucléiques viraux et des acides aminés protéiques. Il devient possible de lier les fonctions des acides nucléiques et des protéines qu'ils codent avec la séquence nucléotidique et d'établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans la pathogenèse de l'infection virale.
Les méthodes de recherche virologique reposent également sur les processus immunologiques (interaction de l'antigène avec les anticorps), les propriétés biologiques du virus (capacité d'hémagglutination, d'hémolyse, activité enzymatique), les caractéristiques de l'interaction du virus avec la cellule hôte (nature de l'effet cytopathique , formation d'inclusions intracellulaires, etc.) .
Dans le diagnostic des infections virales, dans la culture, l'isolement et l'identification des virus, ainsi que dans la production de préparations vaccinales, la méthode de culture tissulaire et cellulaire est largement utilisée. Des cultures cellulaires primaires, secondaires, stables, continues et diploïdes sont utilisées. Les cultures primaires sont obtenues en dispersant les tissus avec des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase). La source de cellules peut être des tissus et des organes (généralement des reins) d'embryons humains et animaux. Une suspension de cellules dans un milieu nutritif est placée dans ce qu'on appelle des matelas, des bouteilles ou des boîtes de Petri, où, après s'être fixées à la surface du récipient, les cellules commencent à se multiplier. Pour l'infection virale, une monocouche cellulaire est généralement utilisée. Le liquide nutritif est drainé, la suspension virale est ajoutée dans certaines dilutions et après contact avec les cellules, un milieu nutritif frais, généralement sans sérum, est ajouté.
Les cellules de la plupart des cultures primaires peuvent être repiquées ; une telle culture est appelée culture secondaire. Avec le passage ultérieur des cellules, une population de cellules de type fibroblaste se forme, capables de se reproduire rapidement, dont la plupart conservent l'ensemble original de chromosomes. Ce sont des cellules dites diploïdes. En cultivant des cellules en série, des cultures cellulaires continues et stables sont obtenues. Au cours des passages, des cellules homogènes à division rapide avec un ensemble hétéroploïde de chromosomes apparaissent. Les lignées cellulaires stables peuvent être monocouches ou en suspension. Les cultures monocouches se développent sous la forme d'une couche continue sur la surface du verre, tandis que les cultures en suspension se développent sous la forme de suspensions dans divers récipients utilisant des dispositifs de mélange. Il existe plus de 400 lignées cellulaires dérivées de 40 espèces animales différentes (dont les primates, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens, les poissons, les insectes) et les humains.
Des morceaux d’organes et de tissus individuels (cultures d’organes) peuvent être cultivés dans des milieux nutritifs artificiels. Ces types de cultures préservent la structure tissulaire, ce qui est particulièrement important pour l’isolement et le passage des virus qui ne se reproduisent pas dans des cultures de tissus indifférenciés (par exemple les coronavirus).
Dans les cultures cellulaires infectées, les virus peuvent être détectés par des modifications de la morphologie cellulaire, des effets cytopathiques qui peuvent être spécifiques, l'apparition d'inclusions, par le dosage des antigènes viraux dans la cellule et dans le liquide de culture ; établir les propriétés biologiques de la descendance virale dans un liquide de culture et titrer les virus dans des cultures tissulaires, des embryons de poulet ou des animaux sensibles ; en identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans des cellules par hybridation moléculaire ou accumulations d'acides nucléiques par la méthode cytochimique utilisant la microscopie à fluorescence.
L’isolement des virus est un processus long et laborieux. Elle est réalisée pour déterminer le type ou le variant du virus circulant dans la population (par exemple, pour identifier un sérovariant du virus de la grippe, une souche sauvage ou vaccinale du virus de la polio, etc.) ; dans les cas où il est nécessaire de prendre des mesures épidémiologiques urgentes ; lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent ; si nécessaire, confirmer le diagnostic préliminaire ; pour l'indication de virus dans les objets environnementaux. Lors de l'isolement des virus, la possibilité de leur persistance dans le corps humain, ainsi que l'apparition d'une infection mixte causée par deux ou plusieurs virus, est prise en compte. Une population génétiquement homogène du virus obtenue à partir d'un virion est appelée clone viral, et le processus d'obtention est appelé clonage.
Pour isoler les virus, on utilise l'infection d'animaux de laboratoire sensibles et d'embryons de poulet, mais le plus souvent, la culture tissulaire est utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symplastes et de syncytia, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par immunofluorescence, hémadsorption, hémagglutination (pour les virus hémagglutinants), etc. . Ces signes ne peuvent être détectés qu’après 2-3 passages du virus.
Pour isoler un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, des embryons de poulet sont utilisés, et pour isoler certains virus Coxsackie et un certain nombre d'arbovirus, des souris nouveau-nées sont utilisées. L'identification des virus isolés est réalisée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes.
Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans une culture tissulaire, déterminant la dilution la plus élevée du liquide contenant le virus à laquelle se produit la dégénérescence tissulaire, les inclusions et les antigènes spécifiques du virus se forment. La méthode des plages peut être utilisée pour titrer un certain nombre de virus. Les plaques, ou colonies négatives de virus, sont des foyers de cellules détruites par le virus dans une culture tissulaire monocouche sous une couche de gélose. Le comptage des colonies permet une analyse quantitative de l’activité infectieuse des virus en partant du principe qu’une particule virale infectieuse forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants intravitales, généralement du rouge neutre ; les plaques n'adsorbent pas le colorant et sont donc visibles sous forme de taches lumineuses sur le fond des cellules vivantes colorées. Le titre du virus est exprimé en nombre d'unités formant des plages pour 1 ml.
La purification et la concentration des virus sont généralement réalisées par ultracentrifugation différentielle suivie d'une centrifugation par concentration ou par gradient de densité. Pour purifier les virus, des méthodes immunologiques, la chromatographie par échange d'ions, des immunosorbants, etc. sont utilisés.
Le diagnostic en laboratoire des infections virales comprend la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériel clinique ; isoler le virus de ce matériel ; sérodiagnostic. Le choix de la méthode de diagnostic en laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la durée de la maladie et des capacités du laboratoire. Le diagnostic moderne des infections virales repose sur des méthodes expresses qui permettent d'obtenir une réponse plusieurs heures après le prélèvement du matériel clinique dans les premiers stades de la maladie. Il s'agit notamment de la microscopie électronique et immunitaire, ainsi que de l'immunofluorescence, la méthode d'hybridation moléculaire. , détection d'anticorps de la classe IgM, etc.
La microscopie électronique des virus colorés négativement permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic des infections virales est limitée aux cas où la concentration de particules virales dans le matériel clinique est assez élevée (10 5 sur 1). ml et plus haut). L’inconvénient de cette méthode est l’incapacité de distinguer les virus appartenant au même groupe taxonomique. Cette déficience est surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie électronique immunitaire. La méthode repose sur la formation de complexes immuns en ajoutant du sérum spécifique aux particules virales, tout en concentrant simultanément les particules virales, permettant leur identification. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. À des fins de diagnostic express, un examen au microscope électronique des extraits de tissus, des matières fécales, du liquide des vésicules et des sécrétions du nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus ; ses capacités sont élargies grâce à l’utilisation d’anticorps marqués.
La méthode d'hybridation moléculaire, basée sur la détection d'acides nucléiques spécifiques du virus, permet de détecter des copies uniques de gènes et n'a pas d'égale en sensibilité. La réaction repose sur l’hybridation de brins d’ADN ou d’ARN complémentaires (sondes) et la formation de structures double brin. La sonde la moins chère est l’ADN recombinant cloné. La sonde est marquée avec des précurseurs radioactifs (généralement du phosphore radioactif). L'utilisation de réactions colorimétriques est prometteuse. Il existe plusieurs options d'hybridation moléculaire : hybridation ponctuelle, hybridation par blot, hybridation sandwich, hybridation in situ, etc.
Les anticorps de la classe IgM apparaissent plus tôt que les anticorps de la classe G (du 3ème au 5ème jour de la maladie) et disparaissent au bout de quelques semaines, leur détection indique donc une infection récente. Les anticorps de la classe lgM sont détectés par immunofluorescence ou par dosage immunoenzymatique utilisant des antisérums anti-μ (sérums contre les chaînes lourdes de l'IgM).
Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir Méthodes de recherche immunologique) : réactions de fixation du complément, inhibition de l'hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, dosage immunoenzymatique, dosage radioimmunologique. Des microméthodes pour de nombreuses réactions ont été développées et leurs techniques sont constamment améliorées. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et pour le sérodiagnostic afin de déterminer l'augmentation des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (le premier sérum est prélevé dans les premiers jours après la maladie, le second - après 2- 3 semaines). Une valeur diagnostique n'est pas inférieure à une multiplication par quatre des anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection d'anticorps de la classe IgM indique une infection récente, alors les anticorps de la classe IgC persistent plusieurs années, et parfois toute la vie.
Pour identifier les antigènes individuels des virus et leurs anticorps dans des mélanges complexes sans purification préalable des protéines, l'immunotransfert est utilisé. La méthode combine le fractionnement des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec une immuno-indication ultérieure des protéines à l'aide de la méthode de dosage immunoenzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de pureté chimique de l'antigène et permet d'identifier des paires antigène-anticorps individuelles. Cette tâche est pertinente, par exemple, dans le sérodiagnostic de l'infection par le VIH, où les réactions faussement positives du test immuno-enzymatique sont causées par la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes cellulaires, qui sont présents en raison d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification des anticorps dans les sérums des patients contre les antigènes viraux internes et externes permet de déterminer le stade de la maladie, et lors de l'analyse des populations, la variabilité des protéines virales. L'immunotransfert pour l'infection par le VIH est utilisé comme test de confirmation pour identifier les antigènes viraux individuels et les anticorps dirigés contre eux. Lors de l’analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. Le grand intérêt de la méthode réside dans la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie de l'ADN recombinant, en établissant leurs tailles et la présence de déterminants antigéniques.
La recherche virologique comprend deux étapes principales : l'isolement des virus et leur identification. Le matériel pour la recherche virologique peut être du sang, d'autres fluides biologiques et pathologiques, des biopsies d'organes et de tissus.
Des tests sanguins virologiques sont souvent effectués pour diagnostiquer les infections à arbovirus. Les virus de la rage, des oreillons et de l'herpès simplex peuvent être trouvés dans la salive. Des prélèvements nasopharyngés sont utilisés pour isoler les agents pathogènes de la grippe et d'autres infections virales respiratoires aiguës, ainsi que de la rougeole. Les adénovirus sont détectés dans les prélèvements conjonctivals. Divers entéro-, adno-, pso-, nora- et rotavirus sont isolés des matières fécales.
Pour isoler les virus, des cultures cellulaires, des embryons de poulet et parfois des animaux de laboratoire sont utilisés.
La plupart des virus pathogènes se distinguent par la présence de tissus et par une spécificité de type ; par exemple, le poliovirus se reproduit uniquement dans les cellules de primates, c'est pourquoi une culture tissulaire appropriée est utilisée pour isoler un virus spécifique. Pour isoler un pathogène inconnu, il est conseillé d'infecter simultanément 3 à 4 cultures cellulaires, en supposant que l'une d'elles puisse être sensible. La présence du virus dans les cultures cellulaires infectées est déterminée par le développement d'une dégénérescence cellulaire spécifique, c'est-à-dire action cytopathogène, détection d'inclusions intracellulaires, ainsi que basée sur la détection d'un antigène spécifique par immunofluorescence, réactions positives d'hémadsorption et d'hémagglutination.
Les embryons d'oiseaux, avec leurs tissus peu différenciés, conviennent à la culture de nombreux virus. La plupart du temps, des embryons de poulet sont utilisés. En se multipliant dans les embryons, les virus peuvent provoquer leur mort (arbovirus), l'apparition d'altérations de la membrane chorion-allantoïque (virus de la variole) ou dans le corps de l'embryon, l'accumulation de gluten dans les liquides embryonnaires (virus de la grippe, des oreillons). ) et l'antigène viral liant le complément.
L'identification des virus est réalisée à l'aide de méthodes immunologiques : réaction d'inhibition de l'hémagglutination, fixation du complément, neutralisation, précipitation sur gel, immunofluorescence.
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