Mikrobiológiai előadás "Immunreakciók. Immunreakciók alkalmazása fertőző betegségek diagnosztizálásában." Előadás: Agglutinációs reakció (RA). Gépezet. Alkatrészek. Színpadi módszerek. Alkalmazás Agglutinációs reakció

Az agglutinációs reakció (RA) a mikrobák vagy más sejtek adhéziója és kicsapódása antitestek hatására elektrolit jelenlétében. A keletkező csapadékot agglutinátumnak nevezzük.

Az RA használatos:

1. Antitestek kimutatása a páciens vérszérumában (szerodiagnózis).

2. Betegből izolált kórokozó mikroorganizmusok tiszta kultúrájának típusának és szerovariánsának meghatározása (szerotipizálás).

Az agglutinációs reakciót például tífuszos és paratífuszos (Vidal-reakció), brucellózisban (Wright, Heddleson-reakció), tularémiában, leptospirózisban és más fertőző betegségekben szenvedő betegek vérszérumában lévő antitestek meghatározására, valamint a betegből izolált kórokozó (bélfertőzések, szamárköhögés stb.). Az RA vércsoportok, Rh faktor stb. meghatározására szolgál.

A reakcióhoz a következő összetevőkre van szükség:

1. Az antigénnek (agglutinogénnek) korpuszkulárisnak kell lennie, azaz élő vagy elpusztult mikroorganizmusok (diagnosztika m), eritrociták vagy más sejtek szuszpenziója. Jellemzően napi ferde agaron termesztett mikroorganizmustenyészetet alkalmaznak. A tenyészetet 3-4 ml izotóniás oldattal lemossuk, steril csőbe visszük, és meghatározzuk a sűrűséget. A szuszpenziónak homogénnek kell lennie, és 1 ml-enként legfeljebb 3 milliárd mikrobasejtet kell tartalmaznia. Az elölt mikrobák szuszpenziója - diagnosztikum - alkalmazása megkönnyíti a munkát (előállítás során).

2. Az antitestek (agglutininok) megtalálhatók a páciens szérumában (szerodiagnosztizálás során) vagy agglutináló szérumban (szerotipizálás során). Az agglutináló szérumokat nyulaknak elölt baktériumokkal történő immunizálásával nyerik.

Agglutináló titer a szérumot legmagasabb hígításának nevezzük, amelyben bizonyos kísérleti körülmények között reagál a megfelelő antigénnel.

Az agglutináló szérumok lehetnek natívak (nem adszorbeáltak) és adszorbeáltak. A kis hígítású natív szérumok nemcsak azokkal a mikroorganizmusokkal lépnek kölcsönhatásba, amelyekkel az állatot a szérum előállításához immunizálták, hanem a rokon típusú mikroorganizmusokkal is, mivel csoportos antitesteket tartalmaznak (a közös antigénekkel rendelkező mikroorganizmusok elleni antitesteket). A natív szérumokat részletes agglutinációs reakcióhoz (szerodiagnózishoz) használják, amely nemcsak a reakció jelenlétét veszi figyelembe, hanem az antitesttiter növekedésének dinamikáját is.

Ha csoportos antitesteket vonnak ki (adszorbeálnak) a natív szérumból olyan rokon baktériumokkal való kölcsönhatás révén, amelyek csoportantigénekkel rendelkeznek, adszorbeált szérumot kapunk. Az adszorbeált szérumok lehetnek monoreceptorok (vagy típusspecifikusak), amelyek csak egy antigénreceptor ellen tartalmaznak antitesteket. A többértékű szérum több adszorbeált vagy nem adszorbeált szérum keverékéből áll. Az üvegagglutinációs reakcióhoz adszorbeált szérumokat használnak.

Ha az állatokat mozgó baktériumokkal immunizáljuk H-antigénnel, H-antitesteket tartalmazó H-agglutináló szérumot kapunk (például Salmonella monoreceptor H-agglutináló szérumot). O-antigénnel végzett immunizálással O-antitesteket tartalmazó O-agglutináló szérumot kapunk (például Salmonella csoporthoz adszorbeált O-agglutináló szérumot, antikolera O-agglutináló szérumot). H- és O-antigénekkel végzett immunizálással H- és O-antitesteket tartalmazó szérumokat kapunk.

Ezenkívül az O-agglutininek finomszemcsés agglutinátot, a H-agglutininek pedig durva szemcsés üledéket termelnek.

3. Elektrolit - izotóniás NaCl-oldat (0,9%-os nátrium-klorid-oldat, desztillált vízben elkészítve).

Két fő módszer létezik az agglutinációs reakció végrehajtására: üvegreakció (néha indikatív vagy lemezreakciónak nevezik) és részletes reakció (kémcsövekben)

Agglutinációs reakció felállítása üvegen. Két csepp szérumot és egy csepp izotóniás nátrium-klorid oldatot csepegtetünk egy zsírmentes tárgylemezre. A diagnosztikai agglutináló szérumot egy hígításban veszik, amely titerétől függően 1:10, 1:25, 1:50 vagy 1:100. A vizsgált mikroorganizmus tenyészetét egy kacs segítségével egy csepp szérumhoz és egy csepp izotóniás oldathoz adjuk, és alaposan összekeverjük. Egy csepp nátrium-klorid mikroorganizmusokkal az antigénkontroll, egy csepp szérum mikroorganizmusok nélkül a szérumkontroll. Nem viheti át a tenyészetet szérumos cseppről NaCl-os cseppre. A reakció szobahőmérsékleten 1-3 percig megy végbe. Ha a szérumkontroll tiszta marad, az antigénkontrollban egyenletes turbiditás figyelhető meg, és agglutinát pelyhek jelennek meg a cseppben, ahol a tenyészet szérummal keveredik, akkor az eredmény pozitívnak minősül. Ha egyenletes zavarosság van a cseppben szérummal és antigénnel, akkor ez negatív eredmény. A reakció világosabban látható sötét háttér előtt.

Szérum

1. antigénkontroll

2. szérum kontroll

Az agglutináció a mikrobák vagy más sejtek összeragadása és kicsapódása antitestek hatására elektrolit (izotóniás nátrium-klorid oldat) jelenlétében. A ragasztott baktériumok (sejtek) csoportjait agglutinátumnak nevezzük. A következő összetevőkre van szükség az agglutinációs reakcióhoz:

1. Antitestek (agglutininek), amelyek egy beteg vagy immunis állat szérumában találhatók.

2. Antigén - élő vagy elölt mikrobák, vörösvérsejtek vagy más sejtek szuszpenziója.

3. Izotóniás (0,9%-os) nátrium-klorid oldat.

A szerodiagnózishoz használt agglutinációs reakciót tífusz és paratífusz (Vidal-reakció), brucellózis (Wright és Heddleson reakció), tularémia stb. esetén alkalmazzák. Az antitest a páciens széruma, az antigén pedig egy ismert mikroba. Mikrobák vagy más sejtek azonosításakor azok szuszpenzióját antigénként, ellenanyagként pedig ismert immunszérumot használnak. Ezt a reakciót széles körben használják bélfertőzések, szamárköhögés stb. diagnosztizálására.

Módszerek az RA szakaszolására

Hozzávetőleges RA az üvegen

Telepített RA

(térfogat módszer)

Koagglutinációs reakció

Hajtogatott RA üvegen (szerazonosítás)

Agglutinációs reakció üvegen. Két csepp specifikus (adszorbeált) szérumot és egy csepp izotóniás nátrium-klorid oldatot csepegtetünk egy zsírmentes tárgylemezre. A nem adszorbeált szérumokat 1:5-1:100 arányban előhígítják. Cseppeket kell felvinni az üvegre úgy, hogy távolság legyen közöttük. A tenyészetet alaposan megőröljük üvegen hurokkal vagy pipettával, majd hozzáadjuk egy csepp izotóniás nátrium-klorid-oldathoz és az egyik szérumcsepphez, és mindegyikben addig keverjük, amíg homogén szuszpenzió nem keletkezik. Egy csepp szérum tenyészet nélkül szérumkontroll.

Figyelem! Nem viheti át a tenyészetet a szérumból egy csepp izotóniás nátrium-klorid oldatba, amely antigénkontrollként szolgál. A reakció szobahőmérsékleten 1-3 percig megy végbe. Ha a szérumkontroll átlátszó marad, az antigénkontrollban egyenletes zavarosság figyelhető meg, és a cseppben agglutinát pelyhek jelennek meg, ahol a tenyészet szérummal keveredik a tiszta folyadék hátterében, a reakció eredménye pozitívnak tekinthető.

Diagnosztikai fiziológiai

szérum + tenyészoldat + tenyészet

Részletes agglutinációs reakció (térfogat módszer). A szérumból sorozatos, leggyakrabban kétszeres hígításokat készítenek. A módszert volumetrikusnak nevezik. A vérszérum antitest-titerének meghatározásához vegyen 6 csövet. Öntsön 1 ml eredeti szérumhígítást 1:50 arányban az első kémcsőbe, és adjon 1 ml sóoldatot mind a 6 kémcsőbe, beosztásos pipettával. Az első kémcső 1:100 arányú szérumhígítást ad 2 ml térfogattal. Vigyen át 1 ml-t az első kémcsőből a második kémcsőbe, ahol a hígítás 1:200 lesz. Tehát készítsen sorozathígításokat a szérumból az első 5 kémcsőben (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Az ötödik kémcsőből öntsön 1 ml-t a fertőtlenítő oldatba. Adjon 2 csepp diagnosticumot mind a 6 kémcsőhöz. A hatodik cső tenyésztési kontroll, mivel csak sóoldatot és diagnosztikát tartalmaz.

Az ilyen ellenőrzés szükséges a tenyészet spontán agglutinációjának kizárásához. A csöveket összerázzuk és termosztátba helyezzük 37°C-on 2 órára, majd egy napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd feljegyezzük az agglutinációs reakció eredményét. Gyermekek szérumával az élet első hónapjaiban végzett agglutinációs reakció során az antitestképződés funkcionális gyengébbsége miatt alacsonyabb antitesttitereket kell azonosítani, amelyet a szérum hígításánál figyelembe kell venni. A kezdeti szérumhígítás 1:25. Az első kémcsőben 1:50, majd 1:100 stb. hígítást kapunk.

Ha a reakció eredménye pozitív, a kémcsövekben elakadt sejtek szemcsék vagy pelyhek formájában láthatóak a tiszta folyadék hátterében. Az agglutinátum fokozatosan leülepszik a fenékre, „esernyő” formájában, és az üledék feletti folyadék kitisztul. Az antigénkontroll egyenletesen zavaros.

Az üledék jellege alapján megkülönböztetünk finom- és durvaszemcsés (pelyhes) agglutinációt. Finom szemcsés agglutináció érhető el, ha O-szérummal dolgozunk. Durva szemcsés - amikor a mozgékony mikrobák kölcsönhatásba lépnek a flagelláris H-szérummal. Gyorsabban fordul elő, mint a finomszemcsés, és a keletkező üledék nagyon laza és könnyen törik.

A reakció intenzitását a következőképpen fejezzük ki:

Minden sejt leülepedt, a kémcsőben lévő folyadék teljesen átlátszó. A reakció eredménye élesen pozitív;

Kevesebb az üledék, a folyadék nem tisztul ki teljesen. A reakció eredménye pozitív;

Még kevesebb az üledék, zavarosabb a folyadék. A reakció eredménye kétséges;

A kémcső alján enyhe üledék van, a folyadék zavaros. Megkérdőjelezhető reakció eredménye;

Nincs üledék, a folyadék egyenletesen zavaros, mint az antigénkontrollban. Negatív reakció eredménye

Az agglutináció a mikrobák vagy más sejtek összeragadása és kicsapódása antitestek hatására elektrolit (izotóniás nátrium-klorid oldat) jelenlétében. A ragasztott baktériumok (sejtek) csoportjait agglutinátumnak nevezzük. A következő összetevőkre van szükség az agglutinációs reakcióhoz:

1. Antitestek (agglutininek), amelyek egy beteg vagy immunis állat szérumában találhatók.

2. Antigén - élő vagy elölt mikrobák, vörösvérsejtek vagy más sejtek szuszpenziója.

3. Izotóniás (0,9%-os) nátrium-klorid oldat.

A szerodiagnózishoz használt agglutinációs reakciót tífusz és paratífusz (Vidal-reakció), brucellózis (Wright és Heddleson reakció), tularémia stb. esetén alkalmazzák. Az antitest a páciens széruma, az antigén pedig egy ismert mikroba. Mikrobák vagy más sejtek azonosításakor azok szuszpenzióját antigénként, ellenanyagként pedig ismert immunszérumot használnak. Ezt a reakciót széles körben használják bélfertőzések, szamárköhögés stb. diagnosztizálására.

Módszerek az RA szakaszolására

Hozzávetőleges RA az üvegen

Telepített RA

(térfogat módszer)

Koagglutinációs reakció

Hajtogatott RA üvegen (szerazonosítás)

Agglutinációs reakció üvegen. Két csepp specifikus (adszorbeált) szérumot és egy csepp izotóniás nátrium-klorid oldatot csepegtetünk egy zsírmentes tárgylemezre. A nem adszorbeált szérumokat 1:5-1:100 arányban előhígítják. Cseppeket kell felvinni az üvegre úgy, hogy távolság legyen közöttük. A tenyészetet alaposan megőröljük üvegen hurokkal vagy pipettával, majd hozzáadjuk egy csepp izotóniás nátrium-klorid-oldathoz és az egyik szérumcsepphez, és mindegyikben addig keverjük, amíg homogén szuszpenzió nem keletkezik. Egy csepp szérum tenyészet nélkül a szérumkontroll.

Figyelem! Nem viheti át a tenyészetet a szérumból egy csepp izotóniás nátrium-klorid oldatba, amely antigénkontrollként szolgál. A reakció szobahőmérsékleten 1-3 percig megy végbe. Ha a szérumkontroll átlátszó marad, az antigénkontrollban egyenletes zavarosság figyelhető meg, és a cseppben agglutinát pelyhek jelennek meg, ahol a tenyészet szérummal keveredik a tiszta folyadék hátterében, a reakció eredménye pozitívnak tekinthető.

Diagnosztikai fiziológiai

szérum + tenyészoldat + tenyészet

Részletes agglutinációs reakció (térfogat módszer). A szérumból sorozatos, leggyakrabban kétszeres hígításokat készítenek. A módszert volumetrikusnak nevezik. A vérszérum antitest-titerének meghatározásához vegyen 6 csövet. Öntsön 1 ml eredeti szérumhígítást 1:50 arányban az első kémcsőbe, és adjon 1 ml sóoldatot mind a 6 kémcsőbe, beosztásos pipettával. Az első kémcső 1:100 arányú szérumhígítást ad 2 ml térfogattal. Vigyen át 1 ml-t az első kémcsőből a második kémcsőbe, ahol a hígítás 1:200 lesz. Tehát készítsen sorozathígításokat a szérumból az első 5 kémcsőben (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Az ötödik kémcsőből öntsön 1 ml-t a fertőtlenítő oldatba. Adjon mind a 6 kémcsőhöz 2 csepp diagnosticumot. A hatodik cső tenyésztési kontroll, mivel csak sóoldatot és diagnosztikát tartalmaz.

Az ilyen ellenőrzés szükséges a tenyészet spontán agglutinációjának kizárásához. A csöveket összerázzuk és termosztátba helyezzük 37°C-on 2 órára, majd egy napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd feljegyezzük az agglutinációs reakció eredményét. A gyermekek szérumával az élet első hónapjaiban végzett agglutinációs reakció során az antitestképződés funkcionális alacsonyabb szintűsége miatt alacsonyabb antitesttitereket kell azonosítani, amelyet a szérum hígításánál figyelembe kell venni. A kezdeti szérumhígítás 1:25. Az első kémcsőben 1:50-es, majd 1:100-as hígítást kapunk stb.

Ha a reakció eredménye pozitív, a kémcsövekben elakadt sejtek szemcsék vagy pelyhek formájában láthatóak a tiszta folyadék hátterében. Az agglutinátum fokozatosan leülepszik a fenékre, „esernyő” formájában, és az üledék feletti folyadék kitisztul. Az antigénkontroll egyenletesen zavaros.

Az üledék jellege alapján megkülönböztetünk finom- és durvaszemcsés (pelyhes) agglutinációt. Finom szemcsés agglutináció érhető el, ha O-szérummal dolgozunk. Durva szemcsés - amikor a mozgékony mikrobák kölcsönhatásba lépnek a flagelláris H-szérummal. Gyorsabban fordul elő, mint a finomszemcsés, és a keletkező üledék nagyon laza és könnyen törik.

A reakció intenzitását a következőképpen fejezzük ki:

Minden sejt leülepedt, a kémcsőben lévő folyadék teljesen átlátszó. A reakció eredménye élesen pozitív;

Kevesebb az üledék, a folyadék nem tisztul ki teljesen. A reakció eredménye pozitív;

Még kevesebb az üledék, zavarosabb a folyadék. A reakció eredménye kétséges;

A kémcső alján enyhe üledék van, a folyadék zavaros. Megkérdőjelezhető reakció eredménye;

Nincs üledék, a folyadék egyenletesen zavaros, mint az antigénkontrollban. Negatív reakció eredménye

1.1. AGGLUTINÁCIÓS REAKCIÓ (RA)

AGGLUTINÁCIÓS REAKCIÓ (RA)

Az agglutinációs reakció sajátossága, könnyű kivitelezése és demonstratív jellege miatt széles körben elterjedt a mikrobiológiai gyakorlatban számos fertőző betegség diagnosztizálására.

Az agglutinációs reakció az antitestek (agglutininek) és a teljes mikrobiális vagy más sejtekkel (agglutinogén) való kölcsönhatás specifitásán alapul. E kölcsönhatás eredményeként részecskék, agglomerátumok képződnek, amelyek pelyhek formájában kicsapódnak (agglutinálódnak).

Az agglutinációs reakcióban élő és elölt baktériumok, spirocheták, gombák, protozoonok, rickettsia, valamint vörösvérsejtek és más sejtek egyaránt részt vehetnek. A reakció két fázisban megy végbe: az első (láthatatlan) specifikus, az antigén és antitestek kombinációja, a második (látható) nem specifikus, az antigének összeragasztása, azaz. agglutinát képződés.

Agglutinát akkor képződik, amikor egy kétértékű antitest egyik aktív centruma egyesül egy antigén determináns csoportjával. Az agglutinációs reakció, mint minden szerológiai reakció, elektrolitok jelenlétében megy végbe.

Külsőleg a pozitív agglutinációs reakció megnyilvánulása kettős jellegű. A csak szomatikus O2 antigénnel rendelkező, flagellált mikrobákban maguk a mikrobasejtek közvetlenül összetapadnak. Ezt az agglutinációt finomszemcsésnek nevezik. 18 22 órán belül következik be. v

A flagellát mikrobáknak két antigénje van: a szomatikus O2 antigén és a flagelláris H2 antigén. Ha a sejteket flagella ragasztja össze, nagy, laza pelyhek képződnek, és ezt az agglutinációs reakciót durvaszemcsésnek nevezik. 24 órán belül megtörténik.

Az agglutinációs reakció mind a páciens vérszérumában található specifikus antitestek minőségi és mennyiségi meghatározása, mind az izolált kórokozó fajtájának meghatározása céljából elvégezhető. v

Az agglutinációs reakció végrehajtható kiterjesztett változatban, amely lehetővé teszi a diagnosztikai titerre hígított szérummal való munkát, és indikatív reakció változatban is, amely elvileg lehetővé teszi specifikus antitestek kimutatását vagy a fajok meghatározását. kórokozó.

A részletes agglutinációs reakció végrehajtása során a vizsgált személy vérszérumában lévő specifikus antitestek kimutatása érdekében a tesztszérumot 1:50 vagy 1:100 hígításban veszik. Ennek oka az a tény, hogy a normál antitestek nagyon magas koncentrációban lehetnek jelen a teljes vagy enyhén hígított szérumban, és ekkor a reakció eredmények pontatlanok lehetnek. A reakció ezen változatában a vizsgált anyag a páciens vére.

A vért éhgyomorra vagy legkorábban étkezés után 6 órával veszik (különben zsírcseppek lehetnek a vérszérumban, ami zavarossá és kutatásra alkalmatlanná teszi). A beteg vérszérumát általában a betegség második hetében veszik fel, a cubitalis vénából sterilen 3 × 4 ml vért gyűjtenek (ekkor a specifikus antitestek maximális mennyisége koncentrálódik). Ismert antigénként egy meghatározott faj elpusztult, de el nem pusztított, specifikus antigénszerkezettel rendelkező mikrobasejtjéből készített diagnosztikát használnak.

A kórokozó fajtájának és típusának meghatározása érdekében részletes agglutinációs reakció végrehajtásakor az antigén a vizsgált anyagból izolált élő kórokozó. Az immundiagnosztikai szérumban lévő antitestek ismertek. v

Az immundiagnosztikai szérumot beoltott nyúl véréből nyerik. A titer (az antitestek kimutatásának maximális hígítása) meghatározása után a diagnosztikai szérumot ampullákba öntik tartósítószer hozzáadásával. Ezt a szérumot az izolált kórokozó antigén szerkezete alapján történő azonosításra használják.

AZ AGGLUTINÁCIÓS REAKCIÓ LEHETŐSÉGEI

Ezekben a reakciókban részecskék (mikrobiális sejtek, vörösvérsejtek és egyéb korpuszkuláris antigének) formájú antigének vesznek részt, amelyeket az antitestek összeragasztanak és kicsapódnak.

Az agglutinációs reakció (RA) végrehajtásához három komponens szükséges: 1) antigén (agglutinogén); 2) antitest (agglutinin) és 3) elektrolit (izotóniás nátrium-klorid oldat).

ORIENTATÍV (lemezes) AGGLUTINÁCIÓS REAKCIÓ (RA)

Egy indikatív vagy lemezes RA-t helyezünk egy tárgylemezre szobahőmérsékleten. Ehhez Pasteur pipettával külön-külön vigyen fel egy csepp szérumot 1:10 1:20 hígításban és egy kontroll csepp izotóniás nátrium-klorid oldatot az üvegre. A telepeket vagy a napi baktériumtenyészetet (egy csepp diagnosztizálást) mindkét bakteriológiai hurokba bevisszük, és alaposan összekeverjük. A reakciókat néhány perc elteltével vizuálisan is figyelembe veszik, esetenként nagyító (x5) használatával. Pozitív RA esetén nagy és kis pelyhek megjelenése figyelhető meg egy csepp szérumban, negatív esetén a szérum egyenletesen zavaros marad.

KÖZVETETT (PASSZÍV) HEMAGLUTINÁCIÓS REAKCIÓ (RNGA, RPGA)

A reakciót: 1) poliszacharidok, fehérjék, baktériumok és más nagy diszperziójú anyagok, rickettsiák és vírusok kimutatására, amelyek agglutininekkel alkotott komplexei nem láthatók hagyományos RA-ban, vagy 2) antitestek kimutatására a betegek szérumában. ezek az erősen diszpergált anyagok és a legkisebb mikroorganizmusok.

Közvetett vagy passzív agglutináció alatt azt a reakciót értjük, amelyben az antitestek kölcsönhatásba lépnek az inert részecskéken (latex, cellulóz, polisztirol, bárium-oxid stb. vagy birka vörösvérsejtjein, emberi vércsoport I(0)) előzetesen adszorbeált antigénekkel.

A passzív hemagglutinációs reakcióban (RPHA) a vörösvérsejteket hordozóként használják. Az antigénnel töltött vörösvértestek összetapadnak ezen antigénnel szembeni specifikus antitestek jelenlétében, és kicsapódnak. Az antigén-szenzitizált eritrocitákat az RPGA-ban vörösvértest-diagnosztikaként használják antitestek kimutatására (szerodiagnózis). Ha a vörösvértestek antitestekkel vannak feltöltve (eritrocita antitest diagnosztizálás), akkor az antigének kimutatására használható.

Színreállítás. A szérum sorozathígításait polisztirol lemezek üregeiben készítik el. Adjon 0,5 ml nyilvánvalóan pozitív szérumot az utolsó előtti üregbe és 0,5 ml fiziológiás oldatot (kontroll) az utolsó üregbe. Ezután minden lyukba adjunk 0,1 ml hígított eritrocitadiagnosztikát, rázzuk fel és tegyük termosztátba 2 órára v

Könyvelés. Pozitív esetben a vörösvértestek a lyuk alján egyenletes, összehajtott vagy szaggatott szélű sejtréteg formájában telepednek le (negatív esetben gomb vagy gyűrű formájában). .

1.2. SEMLEGESÍTÉSI REAKCIÓ. LYSIS,
OPSONOPHAGOCITAS REAKCIÓ, TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ

AZ EXOTOXIN SEMLEGZÉSÉNEK REAKCIÓJA ANTITOXINVAL (RN)

A reakció azon alapul, hogy az antitoxikus szérum képes semlegesíteni az exotoxin hatását. Antitoxikus szérumok titrálására és exotoxin meghatározására használják.

A szérum titrálásakor a megfelelő toxin bizonyos dózisát adják az antitoxikus szérum különböző hígításaihoz. Amikor az antigén teljesen semlegesített, és nincsenek el nem használt antitestek, kezdeti flokkuláció következik be. A flokkulációs reakció nemcsak szérum (például diftéria) titrálására használható, hanem toxin és toxoid titrálására is. A toxinsemlegesítés antitoxinnal való reakciója nagy gyakorlati jelentőséggel bír az antitoxikus terápiás szérumok aktivitásának meghatározására. Ebben a reakcióban az antigén valódi exotoxin.

Az antitoxikus szérum erősségét az AE hagyományos mértékegységei határozzák meg.

1 AE botulinum szérum mennyisége 1000 DLM botulinum toxint semlegesít. A semlegesítési reakció az exotoxin fajtájának vagy típusának meghatározására (tetanusz, botulizmus, diftéria stb. diagnosztizálására) in vitro (Ramon szerint), a mikrobiális sejtek toxicitásának meghatározásakor pedig gélben ( Ouchterlony szerint).

Lizis reakció (RL)

Az immunszérum egyik védő tulajdonsága, hogy képes feloldani a szervezetbe kerülő mikrobákat vagy sejtelemeket.

A sejtoldódást (lízist) okozó specifikus antitesteket lizineknek nevezzük. Az antigén természetétől függően lehetnek bakteriolizinek, citolizinek, spirocetolizinek, hemolizinek stb.

A lizinek csak egy további komplement faktor jelenlétében fejtik ki hatásukat. A komplement, mint a nem specifikus humorális immunitás egyik tényezője, szinte minden testnedvben megtalálható, kivéve a cerebrospinális folyadékot és a szem elülső kamrájának folyadékát. Meglehetősen magas és állandó komplementtartalom figyelhető meg az emberi vérszérumban, és sok a tengerimalacok vérszérumában. Más emlősökben a komplement tartalma a vérszérumban eltérő.

A komplement a szérumfehérjék összetett rendszere. Instabil, és 55 fokban 30 percig összeomlik. Szobahőmérsékleten a komplement két órán belül elpusztul. Nagyon érzékeny a hosszan tartó rázásra, savakra és ultraibolya sugárzásra. A komplementet azonban hosszú ideig (legfeljebb hat hónapig) szárított állapotban, alacsony hőmérsékleten tárolják. A komplement elősegíti a mikrobiális sejtek és a vörösvértestek lízisét.

Különbséget tesznek a bakteriolízis és a hemolízis reakciói között.

A bakteriolízis reakció lényege, hogy amikor egy specifikus immunszérum komplement jelenlétében egyesül a megfelelő homológ élő mikrobiális sejtekkel, akkor mikrobiális lízis megy végbe.

A hemolízis reakció abban áll, hogy amikor a vörösvértesteket komplement jelenlétében specifikus, rájuk immunis (hemolitikus) szérum hatásának teszik ki, megfigyelhető a vörösvértestek feloldódása, azaz. hemolízis.

A hemolízis reakciót a laboratóriumi gyakorlatban a komplement tartomány meghatározására, valamint a diagnosztikai komplementkötési reakciók eredményeinek figyelembevételére használják. A komplementtiter a legkisebb mennyiség, amely 2,5 ml térfogatban hemolitikus rendszerben 30 percen belül a vörösvértestek lízisét okozza. A lízisreakció, mint minden szerológiai reakció, elektrolit jelenlétében megy végbe.

TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK (ALLERGIÁS)

Az antigén bizonyos formái a testtel való ismételt érintkezés során olyan reakciót válthatnak ki, amely alapjában specifikus, de az akut gyulladásos válasz nem specifikus sejtes és molekuláris tényezőit is magában foglalja. A túlérzékenységnek két formája ismert: az azonnali típusú túlérzékenység (IHT) és a késleltetett típusú túlérzékenység (DTH). Az első típusú reakció antitestek részvételével történik, és a reakció legkésőbb 2 órával az allergénnel való ismételt érintkezés után alakul ki. A második típus a gyulladásos T-sejtek (Tgc) segítségével valósul meg, mint a reakció fő effektorai, biztosítva a makrofágok felhalmozódását a gyulladás területén a reakció 6-8 óra elteltével és később jelentkezik.

A túlérzékenységi reakció kialakulását megelőzi egy antigénnel való találkozás és a szenzibilizáció bekövetkezése, azaz. antitestek, aktívan szenzitizált limfociták és más leukociták (makrofágok, granulociták) passzívan szenzitizált citofil antitesteinek megjelenése.

A túlérzékenységi reakcióknak három fejlődési fázisa van: immunológiai; patokémiai; kórélettani.

Az első, specifikus fázisban az allergén kölcsönhatásba lép antitestekkel és (vagy) szenzitizált sejtekkel. A második fázisban az aktivált sejtekből biológiailag aktív anyagok szabadulnak fel. A felszabaduló mediátorok (hisztamin, szerotonin, leukotriének, bradikinin stb.) a megfelelő típusú reakció harmadik fázisára jellemző perifériás hatásokat váltanak ki.

4-es típusú túlérzékenységi reakciók

Az ilyen típusú reakciókat szenzitizált T-helper sejtek, citotoxikus T-limfociták (T-gyilkos sejtek) és a mononukleáris fagocitarendszer aktivált sejtjeinek patogén intercelluláris kölcsönhatásai okozzák, amelyeket az immunrendszer bakteriális antigének általi hosszan tartó stimulációja okoz. a szervezet immunrendszerének relatív elégtelensége a bakteriális kórokozók belső környezetből való eltávolítására fertőző betegségek. Ezek a túlérzékenységi reakciók tuberkulózisos tüdőüregeket, azok elhalását és általános mérgezést okoznak tuberkulózisban szenvedő betegeknél. A tuberkulózisban a bőr granulomatózisa és morfopatogenetikai értelemben a lepra nagyrészt a negyedik típusú túlérzékenységi reakciókból áll.

A túlérzékenységi reakciók negyedik típusának leghíresebb példája a Mantoux-reakció, amely a tuberkulin intradermális injekciójának helyén alakul ki olyan betegben, akinek teste és rendszere érzékeny a mikobakteriális antigénekre. A reakció eredményeként sűrű hiperémiás papula képződik, közepén nekrózissal, amely csak néhány órával (lassan) jelenik meg a tuberkulin intradermális injekciója után. A papulák kialakulása a keringő vér mononukleáris fagocitáinak felszabadulásával kezdődik az érrendszerből az intercelluláris terekbe. Ezzel egy időben megkezdődik a polimorfonukleáris sejtek kivándorlása az érrendszerből. Ezután a neutrofilek infiltrációja alábbhagy, és az infiltrátum túlnyomórészt limfocitákból és mononukleáris fagocitákból áll. Ez különbözik a Mantoux-reakciótól az Arthus-reakciótól, amelyben túlnyomórészt polimorfonukleáris leukociták halmozódnak fel a lézió helyén.

A 4-es típusú túlérzékenységi reakciókban a szenzitizált limfociták antigénekkel történő hosszú távú stimulálása kóros szöveti elváltozások helyén a T helper sejtek kórosan intenzív és elhúzódó citokinek felszabadulásához vezet. A citokinek intenzív felszabadulása a szövetkárosodás helyein az ott elhelyezkedő mononukleáris fagocitarendszer sejtjeinek hiperaktivációját idézi elő, amelyek közül sok hiperaktivált állapotban epithelioid sejtszálakat képez, néhány pedig egymással egyesülve óriássejteket hoz létre. A makrofágok, amelyek felületén bakteriális és vírusantigének vannak kitéve, a Tkillerek (természetes gyilkosok) működése révén elpusztulhatnak.

A túlérzékenységi reakció negyedik típusát egy idegen bakteriális antigén felismerése váltja ki az arra érzékeny T helper sejtek által. A felismerés szükséges feltétele az induktorok interakciója az antigénprezentáló sejtek felszínén kitett antigénekkel endocitózis és idegen immunogének mononukleáris fagociták általi feldolgozása után. Egy másik szükséges feltétel az antigének expozíciója a fő hisztokompatibilitási komplexből származó I. osztályú molekulákkal kombinálva. Az antigénfelismerés után a szenzitizált helper sejtek citokineket és különösen interleukin2-t szabadítanak fel, amely aktiválja a természetes gyilkos sejteket és a mononukleáris fagocitákat. Az aktivált mononukleáris fagociták proteolitikus enzimeket és szabad oxigéngyököket szabadítanak fel, amelyek károsítják a szöveteket.

A bőrallergiás tesztek olyan tesztek, amelyek meghatározzák a szervezet allergénekkel szembeni érzékenységét, meghatározzák a fertőzést, például a tuberkulózist, a brucellózist, a kollektív immunitás szintjét, például a tularémiával szemben. Az allergén beadási helye alapján vannak: 1) bőrtesztek; 2) karifikáció; 3) intradermális; 4) szubkután. Az allergénre adott klinikai reakció a bőrallergia teszt során helyi, általános és fokális, valamint azonnali és késleltetett reakciókra oszlik.

A GNT típusú mediátor lokális reakciói 520 perc elteltével jelentkeznek, bőrpír és hólyag formájában fejeződnek ki, néhány óra múlva eltűnnek, és plusz módszerrel értékelik az erythema mm-ben mért nagyságát. A lokális HRT reakciók 24-48 órán belül jelentkeznek, hosszú ideig tartanak, infiltrátum formájában jelennek meg, esetenként elhalással a közepén, és az infiltrátum mm-ben mért nagyságával, szintén plusz rendszerrel értékelhető. Citotoxikus és immunkomplex típusú HNT esetén a hyperemia és az infiltráció 3-4 óra elteltével figyelhető meg, maximumát 6-8 óra múlva éri el, és körülbelül egy nap múlva csökken. Néha kombinált reakciók figyelhetők meg.

1.3. KIEGÉSZÍTŐ REAKCIÓ (FFR)

Ezt a reakciót laboratóriumi vizsgálatokban használják különféle fertőzések során a vérszérumban lévő antitestek kimutatására, valamint a kórokozó azonosítására antigén szerkezete alapján.

A komplementkötési reakció összetett szerológiai reakció, amelyet nagy érzékenység és specifitás jellemez.

Ennek a reakciónak az a jellemzője, hogy az antigén változása a specifikus antitestekkel való kölcsönhatás során csak komplement jelenlétében következik be. A komplement csak az „antitest antigén” komplexen adszorbeálódik. Az „antitest antigén” komplex csak akkor jön létre, ha affinitás van az antigén és a szérumban lévő antitest között.

A komplement adszorpciója az „antigén antitest” komplexen eltérő hatással lehet az antigén sorsára annak jellemzőitől függően.

Egyes antigének ilyen körülmények között éles morfológiai változásokon mennek keresztül, beleértve az oldódást (hemolízis, Isaev-Pfeiffer jelenség, citolitikus hatás). Mások megváltoztatják a mozgás sebességét (treponema immobilizáció). Megint mások hirtelen pusztító elváltozások (baktericid vagy citotoxikus hatás) nélkül halnak meg. Végül, a komplement adszorpciója nem járhat olyan változásokkal az antigénben, amelyek könnyen megfigyelhetők.

Az RSC mechanizmus szerint két fázisban fordul elő:

1. Az első fázis az „antigén antitest” komplex kialakulása és ezen a komplement komplexen való adszorpciója. A fázis eredménye vizuálisan nem látható (antigén és antitestek kölcsönhatása a komplement kötelező részvételével).
2. A második fázis az antigén megváltozása specifikus antitestek hatására komplement jelenlétében. A fázis eredménye lehet vizuálisan látható vagy nem látható (a reakcióeredmények kimutatása indikátor hemolitikus rendszerrel (birka vörösvértestek és hemolitikus szérum).

A vörösvérsejtek hemolitikus szérum általi elpusztítása csak akkor következik be, ha komplementet adnak a hemolitikus rendszerhez. Ha korábban komplement adszorbeálódott az antigén-antitest komplexen, akkor az eritrociták hemolízise nem következik be.

A kísérlet eredményét úgy értékeljük, hogy minden kémcsőben feljegyezzük a hemolízis jelenlétét vagy hiányát. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a hemolízis teljesen késik, ha a kémcsőben lévő folyadék színtelen, és a vörösvértestek leülepednek az aljára, negatívnak, ha a vörösvértestek teljesen lizálódnak, ha a folyadék intenzív színű („lakk”). vér). A hemolízis késleltetés mértékét a folyadék színének intenzitásától és az alján lévő vörösvérsejt-üledék méretétől (++++, +++, ++, +) függően értékeljük.

Abban az esetben, ha az antigén változásai nem hozzáférhetők a vizuális megfigyeléshez, egy második rendszert kell használni, amely indikátorként működik, lehetővé téve a komplement állapotának felmérését és a reakció eredményére vonatkozó következtetés levonását.

Ezt az indikátorrendszert a hemolízis reakció komponensei képviselik, amelyek magukban foglalják a birka eritrocitákat és a hemolitikus szérumot, amely vörösvértestek (hemolizin) specifikus antitesteket tartalmaz, de nem tartalmaz komplementet. Ezt az indikátorrendszert egy órával a fő RSC felhelyezése után adják a kémcsövekhez. Ha a komplementkötési reakció pozitív, akkor antitest antigén komplex képződik, amely a komplementet önmagán adszorbeálja. Mivel a komplement csak egy reakcióhoz szükséges mennyiségben kerül felhasználásra, és az eritrociták lízise csak komplement jelenlétében történhet meg, így az „antigén antitest” komplexen adszorbeálva a hemolitikus (indikátor) rendszerben a vörösvértestek lízise megtörténik. nem fordul elő. Ha a komplementkötési reakció negatív, az „antigén antitest” komplex nem képződik, a komplement szabad marad, és ha a hemolitikus rendszert hozzáadjuk, vörösvértest lízis következik be.

1.4. DNS-szondák. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR),
IMMUNOENZIM MÓDSZER (ELISA), FLUORESCING ANTESTYME MÓDSZER (FFA)

A GÉNSZONDOLÁS MÓDSZEREI

A molekuláris biológia intenzív fejlesztése és a genetikai kutatás tökéletes módszertani bázisának megteremtése képezte a géntechnológia alapját. A diagnosztika területén kialakult és rohamosan fejlődik egy irány a DNS és RNS specifikus nukleotidszekvenciáinak meghatározására, az úgynevezett génszondázásra. Az ilyen technikák a nukleinsavak azon képességén alapulnak, hogy a komplementer nukleotidok (AT, GC) kölcsönhatása következtében hibridizálnak és kettős szálú szerkezeteket képeznek.

A kívánt DNS (vagy RNS) szekvencia meghatározásához speciális bázisszekvenciával rendelkező úgynevezett polinukleotid próbát hoznak létre. Az összetételébe speciális címkét vezetnek be, amely lehetővé teszi a komplex kialakulásának azonosítását.

Bár a génszondázás nem sorolható az immunkémiai analízis módszerei közé, alapelve (a komplementer struktúrák kölcsönhatása) az immundiagnosztika indikátoros módszereivel azonos módszerekkel valósul meg. Ezenkívül a génpróbáló módszerek lehetővé teszik a fertőző ágensekkel kapcsolatos információk pótlását annak fenotípusos expressziójának hiányában (genomba ágyazott vírusok, „néma” gének).

A DNS-elemzés elvégzéséhez a mintát denaturálják, hogy olyan egyszálú szerkezeteket kapjanak, amelyekkel a DNS- vagy RNS-próbamolekulák reagálnak. A próbák elkészítéséhez vagy természetes forrásból (például egy adott mikroorganizmusból) izolált DNS (vagy RNS) különböző szakaszait, amelyeket általában vektorplazmidokban genetikai szekvenciák formájában mutatnak be, vagy kémiailag szintetizált oligonukleotidokat használnak. Egyes esetekben próbaként fragmensekre hidrolizált genomi DNS-készítményeket, néha RNS-készítményeket, és különösen gyakran riboszómális RNS-t használnak. Ugyanazokat az indikátorokat használják jelölésként, mint a különböző típusú immunkémiai elemzésekben: radioaktív izotópok, fluoreszceinek, biotóp (az avidin-enzim komplex által továbbfejlesztve) stb.

Az elemzés sorrendjét a rendelkezésre álló szonda tulajdonságai határozzák meg

Jelenleg egyre gyakrabban használnak kereskedelmi készleteket, amelyek minden szükséges összetevőt tartalmaznak.

A legtöbb esetben az elemzési eljárás a következő szakaszokra bontható: minta előkészítése (beleértve a DNS extrakciót és denaturálást), minta rögzítése hordozón (leggyakrabban polimer membránszűrő), előhibridizálás, maga a hibridizáció, a nem kötött termékek mosása, kimutatás . Standard DNS- vagy RNS-próbakészítmény hiányában először elő kell nyerni és megjelölni.

A minta elkészítéséhez szükség lehet a vizsgálati anyag előzetes „tenyésztésére”, hogy azonosítani lehessen az egyes baktériumkolóniákat, vagy növelje a vírusok koncentrációját egy sejttenyészetben. A vérszérum-, vizelet-, vérsejtek vagy teljes vérminták közvetlen elemzését is elvégzik fertőző ágens jelenlétére. A sejtszerkezetekből a nukleinsavak felszabadítása érdekében sejtlízist végeznek, és bizonyos esetekben a DNS-készítményt fenollal tisztítják.

A DNS denaturálódása, azaz egyszálú formába való átmenete lúggal való kezeléskor következik be. A nukleinsavmintát ezután egy hordozóra, egy nitrocellulóz- vagy nejlonmembránra rögzítjük, általában 10 perctől 4 óráig tartó, 80 °C-on vákuumban végzett inkubálással. Továbbá, az előhibridizáció folyamatában a szabad kötőhelyek inaktiválását érik el, hogy csökkentsék a próba nemspecifikus kölcsönhatását a membránnal. A hibridizációs folyamat 2-20 óráig tart, a mintában lévő DNS-koncentrációtól, a használt próba koncentrációjától és méretétől függően.

A hibridizáció befejezése és a meg nem kötött termékek kimosása után a képződött komplex kimutatható. Ha a szonda radioaktív címkét tartalmaz, akkor a reakció demonstrálására a membránt fényképes filmre (autoradiográfia) tesszük ki. Más címkék esetében a megfelelő eljárásokat kell alkalmazni.

A legígéretesebb a nem radioaktív (úgynevezett hideg) szondák beszerzése. Ugyanezen alapon dolgoznak ki egy hibridizációs technikát, amely lehetővé teszi a kórokozó jelenlétének megállapítását metszetpreparátumokban és szövetpunkciókban, ami különösen fontos a patomorfológiai elemzésben (in situ hibridizáció).

A génszondázási módszerek fejlesztésének jelentős lépése volt a polimeráz amplifikációs reakció (PCR) alkalmazása. Ez a megközelítés lehetővé teszi egy specifikus (előre ismert) DNS-szekvencia koncentrációjának növelését egy mintában több másolat in vitro szintetizálásával. A reakció végrehajtásához DNS-polimeráz enzimkészítményt, feleslegben lévő szintézishez szükséges dezoxinukleotidokat és úgynevezett primereket adunk a vizsgált DNS-mintához - kétféle, 2025 bázis méretű oligonukleotidot, amelyek megfelelnek a DNS terminális szakaszainak. Érdekes DNS-szekvencia. Az egyik primernek a kódoló DNS-szál olvasási régiójának 53-as olvasási irányban lévő kezdetének másolatának kell lennie, a másodiknak pedig a nem kódoló szál ellentétes végének másolatának kell lennie. Ezután a polimerázreakció minden egyes ciklusával a DNS-másolatok száma megduplázódik.

A primer kötés eléréséhez DNS-denaturáció (olvadás) szükséges 94 °C-on, majd az elegyet 40-55 °C-ra melegítjük.

A reakció végrehajtásához programozható mikrominta-inkubátorokat terveztek, amelyek könnyen váltogatják az optimális hőmérséklet változásait a reakció minden szakaszában.

Az amplifikációs reakció jelentősen megnövelheti az analízis érzékenységét a génszondázás során, ami különösen fontos a fertőző ágens alacsony koncentrációja esetén.

Az amplifikációval végzett génszondázás egyik jelentős előnye a patológiás anyag szubmikroszkópos mennyiségének vizsgálata.

A módszer másik, a fertőző anyagok elemzése szempontjából fontosabb jellemzője a rejtett (néma) gének azonosításának képessége. A génszondázással kapcsolatos módszerek minden bizonnyal szélesebb körben bekerülnek a fertőző betegségek diagnosztizálásának gyakorlatába, ahogy egyre egyszerűbbé és olcsóbbá válnak.

Az ELISA és RIF módszerek nagyrészt kvalitatív vagy félkvantitatív jellegűek. A komponensek nagyon alacsony koncentrációinál az antigén antitest komplex képződése sem vizuálisan, sem egyszerű műszeres eszközökkel nem mutatható ki. Az antigén antitest komplex kimutatása ilyen esetekben akkor végezhető el, ha az antigén vagy antitest kiindulási komponensei közé olyan jelölést viszünk be, amely könnyen kimutatható az analit meghatározott koncentrációjával összehasonlítható koncentrációban.

Jelölőként radioaktív izotópok (például 125I), fluoreszcens anyagok és enzimek használhatók.

A használt címkétől függően létezik radioimmunoassay (RIA), fluoreszcens immunvizsgálat (FIA), enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) stb. Az elmúlt években az ELISA széles körben elterjedt a gyakorlatban, ami a kvantitatív meghatározások lehetőségével jár együtt. , nagy érzékenység, specifikusság és számviteli automatizálás.

Az enzimes immunoassay módszerek olyan módszerek csoportját jelentik, amelyek lehetővé teszik az antigén-antitest komplex kimutatását egy enzim által hasított és színt adó szubsztrát segítségével.

A módszer lényege, hogy az antigén antitest reakció komponenseit egy mért enzimjelöléssel kombinálják. A reagáló antigént vagy antitestet egy enzim jelzi. A szubsztrát enzim hatására bekövetkező átalakulása alapján meg lehet ítélni az antigén antitest reakcióban kölcsönható komponens mennyiségét. Az enzim ebben az esetben az immunreakció markereként szolgál, és lehetővé teszi annak vizuális vagy műszeres megfigyelését.

Az enzimek nagyon kényelmes címkék, mert katalitikus tulajdonságaik lehetővé teszik, hogy erősítőkként működjenek, mivel egy enzimmolekula több mint 1 × 105 molekula katalitikus reakciótermék képződését képes elősegíteni percenként. Olyan enzimet kell kiválasztani, amely hosszú ideig megőrzi katalitikus aktivitását, nem veszíti el, amikor antigénhez vagy antitesthez kötődik, és nagy a specifitása a szubsztráthoz képest.

Az enzimmel jelölt antitestek vagy antigének és konjugátumok előállításának fő módszerei a következők: kémiai, immunológiai és génmanipuláció. Az ELISA-hoz leggyakrabban használt enzimek a torma-peroxidáz, az alkalikus foszfatáz, a galaktozidáz stb.

Az enzimaktivitás kimutatására az antigén-antitest komplexben a reakció vizuális és műszeres rögzítése céljából kromogén szubsztrátokat használnak, amelyek oldatai kezdetben színtelenek, az enzimatikus reakció során színt kapnak, amelynek intenzitása arányos a mennyiséggel. enzim. Így a torma-peroxidáz aktivitásának kimutatására szilárd fázisú ELISA-ban az intenzív barna színt adó 5-aminoszalicilsavat és a narancssárga színt adó orto-fenilén-diamint használjuk szubsztrátként. Az alkalikus foszfatáz és a β-galatozidáz aktivitásának kimutatására nitrofenil-foszfátokat, illetve nitrofenil-galaktozidokat alkalmaznak.

A színes termék képződésében végbemenő reakció eredményét vizuálisan vagy spektrofotométerrel határozzák meg, amely bizonyos hullámhosszú fényelnyelést mér.

Számos lehetőség van az ELISA elvégzésére. Vannak homogén és heterogén lehetőségek.

Az alkalmazott módszer alapján megkülönböztetünk kompetitív és nem kompetitív ELISA módszereket. Ha az első szakaszban csak a vizsgált vegyület és a hozzá tartozó kötőközpontok (antigén és specifikus antitestek) vannak jelen a rendszerben, akkor a módszer nem kompetitív. Ha az első szakaszban a vizsgált vegyület (antigén) és analógja (enzimmel jelölt antigén) jelen van, versenyezve egymással a hiányos specifikus kötőcentrumokhoz (antitestekhez) való kötődésért, akkor a módszer kompetitív. Ebben az esetben minél több tesztantigént tartalmaz az oldat, annál kevesebb a megkötött jelölt antigének száma.

AZ ANTESTEK FLUORESZKOLÁSÁNAK MÓDSZERE (MFA) vagy IMMUNFLUESZCENCIA REAKCIÓ (RIF)

Az immunfluoreszcens módszer a választott módszer egy ismeretlen mikroorganizmus gyors kimutatására és azonosítására a vizsgálati anyagban.

Ag + AT + elektrolit = UV-sugarakban izzó komplex

Fluorokrómmal jelölt mikrobaszérum

A gyakran használt festék a fluoreszcein-izotiocianát FITC

Ennek a módszernek a tanulmányozásakor fluoreszcens mikroszkópot használnak.

RIF rendezése

30 μl FITC-jelölt antitest oldatot viszünk a kenetre.

Helyezze az üveget nedves kamrába és tartsa szobahőmérsékleten 20-25 percig, vagy termosztátban 37 °C-on 15 percig.

Mossa az üveget folyó csapvízben 2 percig, öblítse le desztillált vízzel, és szárítsa meg levegőn.

A megszáradt kenetre egy csepp szerelőfolyadékot csepegtetünk, a kenetet fedőlemezzel lefedjük, és fluoreszcens mikroszkóppal vagy hagyományos optikai mikroszkóp fluoreszcens rögzítésével mikroszkóppal vizsgáljuk.

29. sz. Agglutinációs reakció. Alkatrészek, mechanizmus, beépítési módok. Alkalmazás.
Agglutinációs reakció- egyszerű reakció, amelyben az antitestek megkötik a corpuscularis antigéneket (baktériumok, eritrociták vagy más sejtek, oldhatatlan részecskék a rajtuk adszorbeált antigénekkel, valamint makromolekuláris aggregátumok). Elektrolitok jelenlétében fordul elő, például izotóniás nátrium-klorid oldat hozzáadásakor.
Az agglutinációs reakció különféle változatait alkalmazzák: kiterjedt, indikatív, közvetett stb. Az agglutinációs reakció pelyhek vagy üledék képződésében nyilvánul meg (két vagy több antigénkötő központtal rendelkező antitestekkel „ragasztott” sejtek - 13.1. ábra). Az RA-t a következőkre használják:
1) antitest meghatározások például brucellózisban (Wright, Heddelson-reakció), tífusz- és paratífusz-lázban (Vidal-reakció) és más fertőző betegségekben szenvedő betegek vérszérumában;
2) a kórokozó meghatározása, betegtől elkülönítve;
3) vércsoportok meghatározása vörösvérsejt alloantigén elleni monoklonális antitestek felhasználásával.
Antitestek meghatározása a páciensben részletes agglutinációs reakció végrehajtása: Diagnosticumot (elölt mikrobák szuszpenziója) adunk a páciens vérszérumának hígításaihoz, és több órás 37 °C-os inkubáció után feljegyezzük azt a legmagasabb szérumhígítást (szérumtitert), amelynél agglutináció, azaz csapadék keletkezett. alakított.
Az agglutináció természete és sebessége az antigén és az antitestek típusától függ. Ilyen például a diagnosztikai anyagok (O- és H-antigének) specifikus antitestekkel való kölcsönhatásának sajátosságai. Az O-diagnosticummal (hő hatására elpusztult baktériumok, megtartva a hőstabil O-antigént) az agglutinációs reakció finomszemcsés agglutináció formájában megy végbe. Az agglutinációs reakció H-diagnosticummal (formaldehid által elpusztított baktériumok, megtartva a termolabilis flagelláris H-antigént) durva és gyorsabban megy végbe. Ha meg kell határozni a betegből izolált kórokozót, tegye indikatív agglutinációs reakció, diagnosztikai antitestek (agglutináló szérum) felhasználásával, azaz a kórokozó szerotipizálását végzik el. Az indikatív reakciót egy tárgylemezen hajtjuk végre. A páciensből izolált kórokozó tiszta tenyészetét egy csepp diagnosztikai agglutináló szérumhoz adjuk 1:10 vagy 1:20 hígításban. A közelben kontrollt helyezünk el: szérum helyett egy csepp nátrium-klorid oldatot alkalmazunk. Amikor egy cseppben pelyhes üledék jelenik meg szérummal és mikrobákkal, kémcsövekben részletes agglutinációs reakciót hajtanak végre az agglutináló szérum növekvő hígításával, amelyhez 2-3 csepp kórokozó szuszpenziót adunk. Az agglutinációt az üledék mennyisége és a folyadék tisztaságának mértéke veszi figyelembe. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a diagnosztikai szérum titeréhez közeli hígításban agglutináció figyelhető meg. Ugyanakkor a kontrollokat is figyelembe veszik: az izotóniás nátrium-klorid-oldattal hígított szérumnak átlátszónak kell lennie, a mikrobák szuszpenziójának ugyanabban az oldatban egyenletesen zavarosnak, üledékmentesnek kell lennie.
Különböző rokon baktériumok agglutinálhatók ugyanazzal a diagnosztikai agglutináló szérummal, amely
megnehezíti az azonosításukat. Ezért adszorbeált agglutináló szérumokat használnak, amelyekből
keresztreagáló antitestek rokon baktériumokhoz való adszorpció révén. Az antitestek megmaradnak az ilyen szérumokban,
csak egy adott baktériumra jellemző.