Direktan Coombsov test. Ovaj test se koristi za dokazivanje prisutnosti blokirajućih antitijela fiksiranih u crvenim krvnim zrncima djeteta. Pozitivan direktni test ukazuje na senzibilizaciju i služi kao uvjerljiv znak hemolitičke bolesti novorođenčeta i prije pojave drugih kliničkih znakova. Kao izuzetak i samo u vrlo teškim slučajevima, direktni Coombsov test može biti negativan zbog već nastale, gotovo potpune hemolize senzibiliziranih crvenih krvnih stanica.
Direktni Coombsov test se izvodi na sljedeći način: 5 kapi krvi uzete iz pete djeteta stavlja se u epruvetu i dodaje se 5 ml fiziološke otopine. Dobro promiješajte i centrifugirajte 10 minuta. Bistra tečnost iznad sedimenta crvenih krvnih zrnaca se odvaja. Zatim ponovo dodajte 5 ml fiziološke otopine, promiješajte i centrifugirajte. Nakon tri puta miješanja sa fiziološkom otopinom, crvena krvna zrnca se dobro isperu. Nakon posljednjeg odvajanja supernatanta, sediment eritrocita u količini od 0,1 ml pomiješa se sa 0,9 ml fiziološkog rastvora. Nanesite 2-3 kapi ove mješavine na stakalce i dodajte jednu kap Coombs seruma. Prisustvo aglutinacije ukazuje da je reakcija pozitivna (pozitivan direktni Coombs test). Ispitivanje treba provesti na sobnoj temperaturi iznad 16° kako bi se izbjegao efekat hladnih aglutinina.
Indirektni Coombsov test služi kao dokaz prisustva slobodnih antitijela u majčinom serumu i izvodi se sa majčinim serumom.
Hemolitička bolest novorođenčeta s Rh inkompatibilnošću obično se manifestira nakon druge trudnoće. Prvo dijete se rađa zdravo, drugo sa znacima blage anemije, a tek nakon treće trudnoće rađaju se djeca sa očiglednim znacima hemolitičke bolesti. Samo presenzibilne žene mogu roditi dijete sa simptomima hemolitičke bolesti tokom prve trudnoće. U nekim slučajevima imunizacija uzrokuje pobačaje i mrtvorođenost. Za početak i težinu bolesti važno je stanje posteljice i trajanje izloženosti aglutininima majke fetusu. Kada se aglutinini pojave 10-14 sedmica prije rođenja, dijete obično doživljava subkliničke oblike. Rana pojava aglutinina, 15-26 sedmica prije rođenja, uzrokuje teške oblike bolesti. U svim oblicima bolesti glavni proces je hemoliza. Posljedica reakcije antigen-antitijelo je hemoliza, oštećenje jetrenih i moždanih kapilara. Ovisno o tome koja lezija prevladava, uočavaju se različiti oblici bolesti. Neki anafilaktički fenomeni su takođe opasni. Dovode do stvaranja supstanci sličnih histaminu, uzrokujući ozbiljna oštećenja ćelija jetre, a posebno ganglijskih ćelija bazalnih ganglija, amonovog roga, duguljaste moždine, pa čak i moždane kore. Kada su ćelije jetre oštećene, ekstrahepatičnoj žutici se dodaje hepatična žutica. Djeca umiru zbog teških simptoma kernikterusa. Ako prežive, ostaju simptomi oštećenja nervnog sistema (poremećaji ekstrapiramidnog sistema sa koreoatetotičkim pokretima, osebujan plesački hod, usiljeni pokreti glave, ponekad poremećaj koordinacije voljnih pokreta sa čestim padovima, povećan tonus mišića, mentalni retardacija, odnosno sa znacima takozvane encephalopathia posticteria infantum).
Coombsov test
Direktni Coombsov test je antiglobulinski test (aglutinacija u gelu koji omogućava detekciju potpunih dvovalentnih antitijela), koji otkriva antitijela IgG klase i C3 komponentu komplementa na površini crvenih krvnih stanica. Tipično, antitijela otkrivena direktnim Coombsovim testom imaju široku specifičnost koja nije povezana s dobro utvrđenim antigenom. Pozitivan direktan Coombsov test jasno ukazuje da pacijent ima hemolitičku anemiju, iako ne pate svi pacijenti s pozitivnim direktnim antiglobulinskim testom od ove bolesti. Kod otprilike 10% pacijenata antitijela ili komponente komplementa na membrani crvenih krvnih zrnaca ne mogu se odrediti direktnim Coombsovim testom (test je negativan), ali, ipak, boluju od autoimune hemolitičke anemije. Da bi se razjasnila specifičnost antitijela u takvim slučajevima, koriste se testovi s njihovim eluiranjem. Direktni Coombsov test, pozitivan samo na komplement, obično se odnosi na hladno antitijela tipa IgM. U ovom slučaju, IgM antitijela nisu prisutna na crvenim krvnim zrncima na bazalnoj tjelesnoj temperaturi. Međutim, zbog činjenice da IgM antitijela aktivno fiksiraju komplement, a komplement ostaje na crvenim krvnim zrncima, kod ovog oblika autoimune hemolitičke anemije (hladna agutininska bolest), Coombsov test će biti pozitivan samo na komplement.
Direktni Coombsov test je pozitivan na autoimunu hemolitičku anemiju uzrokovanu toplim antitijelima, autoimunu anemiju uzrokovanu lijekovima (kod uzimanja metildope do 20% pacijenata ima pozitivnu reakciju), adsorpcioni tip hemolitičke anemije, imunokompleksni tip hemolitičkog anemija (test je pozitivan samo na C3), uz autoimunu hemolitičku anemiju uzrokovanu antitijelima na hladnoću - bolest hladnog aglutinina (test je pozitivan samo na C3). Kod paroksizmalne hladne hemoglobinurije, direktni Coombsov test je negativan.
U akutnom periodu bolesti, usled razaranja crvenih krvnih zrnaca na kojima je zabeležen veliki broj antitela, tokom hemolitičke krize, kao i kod nedovoljnog broja antitela tokom hroničnog toka bolesti, negativan može se posmatrati direktni Coombsov test.
| : | ||
|---|---|---|
- Važan uslov za osiguranje kvaliteta laboratorijskih pretraga krvi je uzimanje materijala na prazan želudac, ujutro (prije 12:00).
- 12 sati prije testa treba izbjegavati piti alkohol, pušiti, jesti i ograničiti fizičku aktivnost.
- Ujutro na test krvi možete piti vodu.
- Izbjegavajte uzimanje lijekova; Ako nije moguće prekinuti uzimanje lijeka, morate obavijestiti laboratoriju.
- Preporučljivo je uzeti materijal prije izvođenja bilo kakvih medicinskih dijagnostičkih postupaka.
- Prilikom procjene nivoa hormona kod žena, važno je uzeti u obzir dan menstrualnog ciklusa kada je najoptimalnije mjeriti određene hormone. Ove informacije možete dobiti od svog ljekara.
| Indeks | Karakteristično |
|---|---|
| Analizator i sistem za testiranje | Gel kartice; DiaMed AG (Švicarska) |
| Referentne vrijednosti | Negativan rezultat / Pozitivan rezultat |
| Interferirajući faktori. Lijekovi | |
| Pozitivan test je moguć pri uzimanju sledećih lekova: acetaminofen, salicilna kiselina, aminopirin, antihistaminici, karbromal, cefalosporini, hlorpromazin, hlorpropamid, cisplatin, klonidin, dipiron, etosuksimid, fenfluramin, fuadin, hidrazonizid, inzulin, ibuhlorotiazid, inzulin, levodin ups, mefenaminska kiselina, melfalan, metadon, metildopa, metilsergid, nomifenzin, penicilamin, penicilini, fenacetin, fenilbutazon, probenecid, prokainamid, kinidin, kinin, rifampin, sulfonomicin, trimelfontomicin litični anhidrid | |
| Indikacije za upotrebu | |
|
|
| Interpretacija rezultata | |
|
Normalno, direktni Coombsov test je negativan. Pozitivan Coombs test za:
|
|
Coombsov test je test krvi koji se radi kako bi se otkrilo da li krv sadrži određena antitijela koja mogu biti nesigurna. Ova antitijela se lijepe za crvena krvna zrnca i mogu napasti imunološki sistem i uzrokovati štetu na druge načine. U medicinskoj terminologiji, ova studija se naziva i antiglobulinski test (AGT).
Vrste Coombsovih uzoraka
Postoje dvije vrste Coombsovih testova - direktni i indirektni.
Direktan Coombsov test, također poznat kao direktni (DAT), otkriva auto-antitijela koja se vezuju za površinu crvenih krvnih zrnaca. Ova antitijela se ponekad stvaraju u tijelu zbog određenih bolesti ili prilikom uzimanja određenih lijekova, kao što su prokainamid, metildopa ili kinidin.
Ova antitijela su opasna jer ponekad uzrokuju anemiju uništavanjem crvenih krvnih stanica.
Ovaj test se ponekad naređuje kako bi se dijagnosticirao uzrok žutice ili anemije.
Normalno, Coombsova reakcija je negativna.
Pozitivno za:
- hemolitička bolest novorođenčadi;
- autoimuna hemoliza;
- hemolitičke transfuzijske reakcije;
- imunohemolitička anemija izazvana lijekovima.
Indirektni Coombsov test, također poznat kao , koristi se za otkrivanje antitijela na crvena krvna zrnca koja se nalaze u krvnom serumu (serum je bistra žuta tekućina krvi koja ostaje nakon što su crvena krvna zrnca i koagulant eliminirani).
Indirektni Coombsov test se koristi tokom transfuzije krvi kako bi se utvrdilo da li krv davaoca odgovara krvi primaoca. Ovo se zove test kompatibilnosti i pomaže u sprečavanju bilo kakve štetne reakcije na krv davaoca. Ovaj test se preporučuje i trudnicama. Neke žene imaju IgG antitijela, koja mogu proći kroz placentu u fetalnu krv i oštetiti novorođenče, uzrokujući hemolitičku bolest poznatu kao hemolitička anemija.
Procedura
Krv se vadi štrcaljkom iz vene, obično sa stražnje strane šake ili pregiba lakta. Prije toga, mjesto uboda se temeljito dezinficira, a nakon uzimanja krvi stavlja se čista gaza ili vata.
Dobivena krv se pročišćava u laboratoriju i crvena krvna zrnca se odvajaju. Uzorak se zatim testira uzastopno upotrebom različitih seruma i Coombsovih reagensa, koji se kontrastiraju. Ako nema aglutinacije (skupljanja crvenih krvnih zrnaca), to znači pozitivan rezultat.
Međutim, ako je test negativan, to znači da u krvi postoje antitijela koja djeluju protiv crvenih krvnih stanica. To može ukazivati na različite bolesti, kao što je anemija (bilo prirodna ili uzrokovana lijekovima), sifilis ili infekcija mikoplazmama. Nakon dobijanja rezultata, ljekar će propisati odgovarajući tretman.
Video
Antitela, koji se nalazi na površini eritrocita, može biti u statičkom ili slobodnom stanju krvna plazma. U zavisnosti od stanja antitijela, izvodi se direktna ili indirektna Coombsova reakcija. Ako postoji razlog za vjerovanje da su antitijela fiksirana na površini crvenih krvnih zrnaca, izvodi se direktan Coombsov test. U ovom slučaju, test se odvija u jednoj fazi - zbrajanju antiglobulinski serum. Ako su nekompletna antitijela prisutna na površini crvenih krvnih stanica, aglutinacija crvena krvna zrnca
Indirektna reakcija
Indirektna Coombsova reakcija se javlja u 2 faze. Prvo morate umjetno implementirati senzibilizacija crvena krvna zrnca Da bi se to postiglo, crvena krvna zrnca i krvni serum koji se testira se inkubiraju, što uzrokuje fiksiranje antitijela na površini crvenih krvnih stanica. Nakon čega se provodi druga faza Coombsovog testa - dodavanje antiglobulinskog seruma.
Reakcija precipitacije - RP (od latinskog praecipilo precipitirati) je stvaranje i taloženje kompleksa rastvorljivog molekularnog antigena sa antitelima u obliku zamućenja tzv. precipitat. Nastaje mešanjem antigena i antitela u ekvivalentnim količinama, višak jednog od njih smanjuje nivo formiranja imunog kompleksa. Reakcija precipitacije se izvodi u epruvetama (reakcija precipitacije prstena), u gelovima, hranljivim medijima itd. Ouchterlony, radiap imunodifuzija, imunoepektroforeza i sl.
|
Prstenasta reakcija precipitacije. Reakcija se izvodi u uskim epruvetama za precipitaciju: rastvorljivi antigen se nanosi na imuni serum. Sa optimalnim omjerom antigena i antitijela, na granici ova dva rješenja formira se neprozirni sloj. taložni prsten. Ako se kao antigeni u reakciji koriste prokuhani i filtrirani ekstrakti tkiva, tada se ova reakcija naziva prva reakcija termoprecipitacije (reakcija u kojoj se otkriva antraks hapten). | |
|
Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija. Za postavljanje reakcije, tanak sloj otopljenog agar gela se izlije na staklenu ploču i nakon stvrdnjavanja u njoj se izrezuju bunari. Antigeni i imunološki serumi se stavljaju odvojeno u jažice gela, koje difundiraju jedna prema drugoj. Na mjestu susreta, u ekvivalentnim proporcijama, formiraju talog u obliku bijele pruge. U višekomponentnim sistemima između jažica sa antigenima i antitelima pojavljuje se nekoliko linija precipitata; u identičnim AG, linije precipitata se spajaju; u neidentičnim AG se seku. |
|
|
Radijalna imunodifuzijska reakcija. Imuni serum sa rastopljenim agar gelom ravnomjerno se sipa na staklo. Nakon stvrdnjavanja u gelu, prave se jažice u koje se stavlja antigen u različitim razblaženjima. Antigen, difundirajući u gel, formira prstenaste precipitacijske zone oko jažica sa antitelima. Prečnik taložnog prstena je proporcionalan koncentraciji antigena. Reakcija se koristi za određivanje imunoglobulina različitih klasa, komponenti sistema komplementa itd. u krvnom serumu. |
|
|
Imunoelektroforeza- kombinacija metode elektroforeze i imunoprecipitacije: mješavina antigena se unosi u jažice gela i odvaja u gelu pomoću elektroforeze, zatim se imunoserum dodaje u žlijeb paralelno sa zonama elektroforeze, čija antitijela difundiraju u gel i formiraju precipitacijske linije na mestu „susreta“ sa antigenom. |
|
|
Reakcija flokulacije(prema Ramonu) (od latinskog f1oecus - ljuspice vune) - pojava opalescencije ili flokulantne mase (imunoprecipitacije) u epruveti tokom reakcije toksin - antitoksin ili toksoid - antitoksin. Koristi se za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida. |
HLA kucanje- proučavanje ljudskog glavnog kompleksa histokompatibilnosti - HLA kompleksa. Ova formacija uključuje regiju gena na hromozomu 6 koji kodiraju HLA antigene uključene u različite imunološke odgovore.
Zadaci za HLA kucanje može biti vrlo različita - biološka identifikacija (HLA tip se nasljeđuje uz roditeljske gene), određivanje predispozicije za razne bolesti, odabir donora za transplantaciju organa - u ovom slučaju se upoređuju rezultati HLA tipizacije tkiva donora i primaoca. Koristeći HLA tipizaciju, utvrđuje se koliko su supružnici slični ili različiti u pogledu antigena histokompatibilnosti kako bi se dijagnosticirali slučajevi neplodnosti.
HLA kucanje sugerira Analiza HLA polimorfizma a provodi se dvije metode - serološkom i molekularno genetičkom. Klasična serološka metoda HLA tipizacije zasniva se na mikrolimfocitotoksičnom testu, a molekularna metoda koristi PCR (lančana reakcija polimeraze).
Serološki HLA kucanje sprovedeno na izolovanim populacijama ćelija. Antigene glavnog kompleksa histokompatibilnosti prenose uglavnom limfociti. Stoga se suspenzija T limfocita koristi kao glavni nosilac antigena klase I, a suspenzija B limfocita za određivanje antigena HLA klase II. Za izolaciju potrebne populacije stanica iz pune krvi koristi se centrifugiranje ili imunomagnetsko odvajanje. Vjeruje se da prva metoda može dovesti do lažno pozitivnih podataka, jer to rezultira smrću nekih stanica. Druga metoda je prepoznata kao specifičnija - više od 95% ćelija ostaje održivo.
Ali osnova za izvođenje limfocitotoksičnog testa HLA kucanje je specifičan serum koji sadrži antitijela na različite alelne varijante antigena HLA klase I i II. Serološkim testom se može utvrditi HLA tip ispitivanjem koji serumi reaguju sa limfocitima, a koji ne.
Ako dođe do reakcije između stanica i seruma, rezultat je stvaranje kompleksa antigen-antitijelo na površini stanice. Nakon dodavanja otopine koja sadrži komplement, dolazi do lize stanica i smrti. Serološki test tipizacije HLA se procjenjuje korištenjem fluorescentne mikroskopije za procjenu pozitivnih (crvena fluorescencija) i negativnih (zelena fluorescencija) reakcija, ili fazno-kontrastne mikroskopije za bojenje jezgara mrtvih ćelija. Rezultat HLA tipizacije se dobija uzimajući u obzir specifičnost reagovanih seruma i grupa antigena unakrsne reakcije, kao i intenzitet reakcije citotoksičnosti.
Nedostaci serološke HLA kucanje su prisustvo unakrsnih reakcija, slab afinitet antitela ili niska ekspresija HLA antigena, odsustvo proteinskih proizvoda u nizu HLA gena.
Modernije, molekularne metode HLA kucanje koriste već standardizovane sintetičke uzorke koji ne reaguju sa antigenima na površini leukocita, već sa DNK i direktno ukazuju koji su antigeni prisutni u uzorku. Molekularne metode ne zahtijevaju živa bijela krvna zrnca koja se mogu proučavati, a dovoljno je nekoliko mikrolitara krvi ili se možete ograničiti na struganje sa oralne sluznice.
Molekularna genetika HLA kucanje koristi PCR metodu, čiji je prvi korak dobijanje čiste genomske DNK (iz pune krvi, suspenzije leukocita, tkiva).
Uzorak DNK se zatim kopira - amplificira in vitro korištenjem prajmera (kratka jednolančana DNK) specifična za specifični HLA lokus. Krajevi svakog para prajmera moraju biti striktno komplementarni jedinstvenoj sekvenci koja odgovara specifičnom alelu, inače neće doći do amplifikacije.
Nakon PCR-a, tokom ponovljenog kopiranja, dobija se veliki broj DNK fragmenata koji se mogu vizuelno proceniti. Da bi se to postiglo, reakcione smjese se podvrgavaju elektrolizi ili hibridizaciji, a da li je došlo do specifičnog pojačanja utvrđuje se pomoću programa ili tablice. Rezultat HLA tipizacije je predstavljen u obliku sveobuhvatnog izvještaja na nivou gena i alela. Zbog standardizacije korištenih uzoraka, molekularni HLA kucanje tačnije serološki. Osim toga, pruža više informacija (više novih DNK alela) i viši nivo detalja, jer vam omogućava da identifikujete ne samo antigene, već i same alele, koji određuju koji je antigen prisutan u ćeliji.
Reakcija imunološke lize. Reakcija se zasniva na sposobnosti specifičnih antitela da formiraju imune komplekse sa ćelijama, uključujući eritrocite i bakterije, što dovodi do aktivacije sistema komplementa klasičnim putem i lize ćelija. Od reakcija imunološke lize najčešće se koristi reakcija hemolize, a reakcija bakteriolize rijetko se koristi (uglavnom u diferencijaciji kolere i vibrija sličnih koleri).
Reakcija hemolize. Pod utjecajem reakcije s antitijelima u prisustvu komplementa, zamućena suspenzija crvenih krvnih zrnaca pretvara se u svijetlocrvenu prozirnu tekućinu - "krv laka" zbog oslobađanja hemoglobina. Prilikom postavljanja dijagnostičke reakcije fiksacije komplementa (FFR), reakcija hemolize se koristi kao indikator: za testiranje prisutnosti ili odsustva (fiksacije) slobodnog komplementa.
Lokalna reakcija hemolize u gelu(Erne reakcija) je jedna od varijanti reakcije hemolize. Omogućava vam da odredite broj ćelija koje stvaraju antitijela. Broj ćelija koje luče antitijela - hemolizine - određen je brojem hemoliznih plakova koji se pojavljuju u agar gelu koji sadrži eritrocite, suspenziju stanica limfoidnog tkiva koje se proučava i komplementa.
Imunofluorescentna metoda
(RIF, reakcija imunofluorescencije) je metoda za detekciju specifičnih Ags (Abs) pomoću Abs (Ags) konjugiranih na fluorohrom. Ima visoku osjetljivost i specifičnost. Koristi se za ekspresnu dijagnostiku infekcija. bolesti (identifikacija patogena u materijalu za istraživanje), kao i za određivanje Ab i površinskih receptora i markera leukocita (imunofenotipizacija) i drugih ćelija. Direktno I. m. sastoji se od obrade dijela tkiva ili razmaza od patološkog materijala ili mikrobne kore koji sadrži specifične Abs konjugirane s fluorohromom; preparat se ispere da se oslobodi nevezanih abs i pregleda pod fluorescentnim mikroskopom. U pozitivnim slučajevima, svijetleći imunološki kompleks pojavljuje se oko periferije objekta. Kontrola je neophodna kako bi se isključila nespecifična luminiscencija. At indirektno. Njih. u prvoj fazi, presjek tkiva ili razmaz se tretira nefluorescentnim specifičnim sredstvom, u drugom - luminiscentnim sredstvom protiv -globulina životinje koja je korištena u prvoj fazi. U pozitivnom slučaju formira se blistavi kompleks koji se sastoji od Ar, At prema njemu i At protiv At (sendvič metoda). Pored fluorescentnog mikroskopa, RIF se uzima u obzir prilikom fenotipizacije ćelija. laserski sorter ćelija .
Protočna citometrija- metoda optičkog mjerenja parametara ćelije, njenih organela i procesa koji se u njoj odvijaju.
Tehnika uključuje detekciju rasipanja svjetlosti iz laserskog snopa dok ćelija prolazi kroz nju u mlazu tekućine, a stupanj disperzije svjetlosti omogućava da se dobije predodžbu o veličini i strukturi ćelije. Osim toga, analiza uzima u obzir nivo fluorescencije hemijskih spojeva koji su dio ćelije (autofluorescencija) ili su dodani uzorku prije protočne citometrije.
Suspenzija ćelija, prethodno obeležena fluorescentnim monoklonskim antitelima ili fluorescentnim bojama, ulazi u tok tečnosti koji prolazi kroz protočnu ćeliju. Uslovi su odabrani tako da se ćelije redaju jedna za drugom zbog tzv. hidrodinamičko fokusiranje mlaza u mlazu. U trenutku kada ćelija pređe laserski snop, detektori bilježe:
raspršivanje svjetlosti pod malim uglovima (od 1° do 10°) (ova karakteristika se koristi za određivanje veličine ćelija).
rasipanje svetlosti pod uglom od 90° (omogućava nam da procenimo odnos jezgra/citoplazma, kao i heterogenost i granularnost ćelija).
Intenzitet fluorescencije kroz nekoliko kanala fluorescencije (od 2 do 18-20) - omogućava vam da odredite subpopulacijski sastav ćelijske suspenzije itd.
Reakcija aglutinacije za određivanje anti-Rhesus antitijela (indirektni Coombsov test)primijeniti kod pacijenata sa intravaskularnom hemolizom. Kod nekih od ovih pacijenata detektuju se anti-Rhesus antitijela, koja su nepotpuna i monovalentna. Oni specifično stupaju u interakciju s Rh-pozitivnim eritrocitima, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Prisustvo takvih nekompletnih antitijela utvrđuje se indirektnim Coombsovim testom. Da bi se to postiglo, antiglobulinski serum (antitijela protiv humanih imunoglobulina) dodaje se u sistem anti-Rh antitijela + Rh-pozitivni eritrociti, što uzrokuje aglutinaciju eritrocita. Koristeći Coombsovu reakciju dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunog porijekla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčeta: eritrociti Rh-pozitivnog fetusa kombinuju se s nekompletnim antitijelima na Rh faktor koji cirkuliraju u krvi, a koji imaju prošla kroz placentu od Rh negativne majke.
Mehanizam. Poteškoća u identifikaciji nekompletnih (monovalentnih) antitijela nastaje zbog činjenice da ova antitijela, kada se vežu za epitope specifičnog antigena, ne formiraju rešetkastu strukturu i reakcija između antigena i antitijela nije otkrivena ni aglutinacijom, precipitacijom, ili druge testove. Za identifikaciju formiranih kompleksa antigen-antitijelo potrebno je koristiti dodatne test sisteme. Za otkrivanje nepotpunih antitijela, na primjer na Rh antigen eritrocita u krvnom serumu trudnice, reakcija se provodi u dvije faze: 1) eritrociti koji sadrže Rh antigen dodaju se u dvostruka razrjeđenja test seruma i čuvaju na 37 °C sat vremena; 2) zečji anti-humani antiglobulinski serum (u prethodno titriranom radnom razblaženju) dodaje se u eritrocite koji su temeljito isprani nakon prve faze. Nakon inkubacije od 30 minuta na 37 °C, rezultati se procjenjuju prisustvom hemaglutinacije (pozitivna reakcija). Potrebno je kontrolisati sastojke reakcije: 1) antiglobulinski serum + crvena krvna zrnca za koja se zna da su senzibilizirana specifičnim antitelima; 2) eritrociti tretirani normalnim serumom + antiglobulinski serum; 3) Rh-negativni eritrociti tretirani test serumom + antiglobulinski serum.
50. Reakcija pasivne hemaglutinacije. Mehanizam. Komponente. Aplikacija.
Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA, RPGA) temelji se na upotrebi eritrocita (ili lateksa) s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma pacijenata uzrokuje da se eritrociti zalijepe zajedno i ispadnu na dno epruveta ili ćelija u obliku zupčastog sedimenta.
Komponente. Za izvođenje RNGA mogu se koristiti eritrociti ovaca, konja, zečeva, pilića, miševa, ljudi i drugih, koji se pohranjuju za buduću upotrebu tretiranjem formaldehidom ili glutaraldehidom. Kapacitet adsorpcije eritrocita se povećava kada se tretiraju rastvorima tanina ili hrom-hlorida.
Antigeni u RNGA mogu biti polisaharidni antigeni mikroorganizama, ekstrakti bakterijskih vakcina, antigeni virusa i rikecija, kao i druge supstance.
Crvena krvna zrnca senzibilizirana hipertenzijom nazivaju se eritrocitni dijagnostici. Za pripremu eritrocitnog dijagnostikuma najčešće se koriste ovčji eritrociti koji imaju visoku adsorbirajuću aktivnost.
Aplikacija. RNGA se koristi za dijagnostiku infektivnih bolesti, određivanje gonadotropnog hormona u urinu pri utvrđivanju trudnoće, za identifikaciju preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.
Mehanizam. Test indirektne hemaglutinacije (IRHA) ima značajno veću osjetljivost i specifičnost od testa aglutinacije. Koristi se za identifikaciju patogena po njegovoj antigenskoj strukturi ili za indikaciju i identifikaciju bakterijskih produkata – toksina u patološkom materijalu koji se proučava. U skladu s tim, koristi se standardna (komercijalna) dijagnostika eritrocitnih antitijela koja se dobijaju adsorpcijom specifičnih antitijela na površini taniziranih (tretiranih taninom) eritrocita. Serijska razblaženja ispitivanog materijala pripremaju se u jamicama plastičnih ploča. Zatim se u svaku jažicu dodaje jednaka zapremina od 3% suspenzije crvenih krvnih zrnaca napunjenih antitijelima. Ako je potrebno, reakcija se izvodi paralelno u nekoliko redova jažica sa eritrocitima napunjenim antitijelima različitih grupnih specifičnosti.
Nakon 2 sata inkubacije na 37 °C, rezultati se uzimaju u obzir, procjenjujući izgled sedimenta crvenih krvnih zrnaca (bez mućkanja): s negativnom reakcijom nastaje sediment u obliku kompaktnog diska ili prstena na dno bunara s pozitivnom reakcijom pojavljuje se karakterističan čipkasti sediment crvenih krvnih zrnaca, tanak film s neravnim rubovima.
