Reakcija aglutinacije (RA) je adhezija i precipitacija mikroba ili drugih ćelija pod uticajem antitela u prisustvu elektrolita. Nastali precipitat naziva se aglutinat.
RA se koristi:
1. Otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta (serodijagnostika).
2. Odrediti vrstu i serovar čiste kulture patogenih mikroorganizama izolovanih od pacijenta (serotipizacija).
Reakcija aglutinacije se koristi za određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, kod trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (reakcija Wright, Heddleson), tularemije, leptospiroze i drugih zaraznih bolesti, kao i za određivanje patogen izoliran od pacijenta (crijevne infekcije, veliki kašalj, itd.). RA se koristi za određivanje krvnih grupa, Rh faktora itd.
Za reakciju su potrebne sljedeće komponente:
1. Antigen (aglutinogen) mora biti korpuskularan, odnosno, to je suspenzija živih ili ubijenih mikroorganizama (dijagnostika m), eritrocita ili drugih ćelija. Obično se koristi svakodnevna kultura mikroorganizama uzgojenih na agarima. Kultura se ispere sa 3 - 4 ml izotonične otopine, prenese u sterilnu epruvetu i odredi se gustina. Suspenzija mora biti homogena i sadržavati do 3 milijarde mikrobnih ćelija po 1 ml. Upotreba suspenzije ubijenih mikroba - dijagnostikuma - olakšava rad (pripremljene u proizvodnji).
2. Antitijela (aglutinini) se nalaze u pacijentovom serumu (tokom serodijagnostike) ili u aglutinirajućem serumu (tokom serotipizacije). Aglutinirajući serumi se dobijaju imunizacijom zečeva ubijenim bakterijama.
Titar aglutinacije serum se naziva njegovim najvećim razrjeđenjem, u kojem reagira s odgovarajućim antigenom pod određenim eksperimentalnim uvjetima.
Aglutinirajući serumi mogu biti nativni (neadsorbirani) i adsorbirani. Nativni serumi u malim razrjeđenjima djeluju ne samo s vrstom mikroorganizama s kojima je životinja imunizirana da bi se dobio serum, već i sa srodnim vrstama mikroorganizama, budući da sadrže grupna antitijela (antitijela na mikroorganizme koji imaju zajedničke antigene). Nativni serumi se koriste za detaljnu reakciju aglutinacije (za serodijagnostiku), koja uzima u obzir ne samo prisustvo reakcije, već i dinamiku povećanja titra antitijela.
Ako se grupna antitijela ekstrahuju (adsorbiraju) iz nativnog seruma interakcijom sa srodnim bakterijama koje imaju grupne antigene, dobijaju se adsorbirani serumi. Adsorbirani serumi mogu biti monoreceptorski (ili tip-specifični), koji sadrže antitijela samo na jedan antigenski receptor. Polivalentni serumi se sastoje od mješavine nekoliko adsorbiranih ili neadsorbiranih seruma. Za reakciju aglutinacije stakla koriste se adsorbirani serumi.
Kada se životinje imuniziraju pokretnim bakterijama s H-antigenom, dobivaju se serumi koji sadrže H-antitijela koja sadrže H-aglutinaciju (na primjer, H-aglutinirajući serum sa monoreceptorom Salmonella). Imunizacijom O-antigenom dobijaju se O-aglutinirajući serumi koji sadrže O-antitijela (na primjer, O-aglutinirajući serum adsorbirani salmonelom, O-aglutinirajući serum protiv kolere). Imunizacijom H- i O-antigenima dobijaju se serumi sa H- i O-antitelima.
Štaviše, O-aglutinini proizvode sitnozrnati aglutinat, a H-aglutinini proizvode krupnozrnati sediment.
3. Elektrolit - izotonični rastvor NaCl (0,9% rastvor natrijum hlorida pripremljen u destilovanoj vodi).
Postoje dvije glavne metode za izvođenje reakcije aglutinacije: reakcija na staklu (ponekad nazvana indikativna ili pločasta reakcija) i detaljna reakcija (u epruvetama)
Postavljanje reakcije aglutinacije na staklu. Dvije kapi seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Dijagnostički aglutinirajući serum uzima se u jednom razrjeđivanju, koje, ovisno o njegovom titru, iznosi 1:10, 1:25, 1:50 ili 1:100. Kultura mikroorganizma koji se proučava dodaje se u jednu kap seruma i kap izotonične otopine pomoću petlje i temeljito promiješa. Kap natrijum hlorida sa mikroorganizmima je kontrola antigena, kap seruma bez mikroorganizama je kontrola seruma. Ne možete prenijeti kulturu iz kapi sa serumom u kap s NaCl. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane bistra, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje je kultura pomiješana sa serumom, onda se rezultat smatra pozitivnim. Ako postoji ujednačena zamućenost kapi sa serumom i antigenom, onda je to negativan rezultat. Reakcija je jasnije vidljiva na tamnoj pozadini.
Serum
1. kontrola antigena
2. kontrola seruma
Aglutinacija je lijepljenje i taloženje mikroba ili drugih stanica pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). Grupe slijepljenih bakterija (ćelija) nazivaju se aglutinati. Za reakciju aglutinacije potrebne su sljedeće komponente:
1. Antitijela (aglutinini) koja se nalaze u serumu bolesne ili imune životinje.
2. Antigen - suspenzija živih ili ubijenih mikroba, crvenih krvnih zrnaca ili drugih ćelija.
3. Izotonični (0,9%) rastvor natrijum hlorida.
Reakcija aglutinacije za serodijagnostiku koristi se za trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija), brucelozu (reakcija Wright i Heddleson), tularemiju itd. Antitijelo je pacijentov serum, a antigen je poznati mikrob. Prilikom identifikacije mikroba ili drugih ćelija, njihova suspenzija se koristi kao antigen, a poznati imunološki serum se koristi kao antitijelo. Ova reakcija se široko koristi za dijagnosticiranje crijevnih infekcija, velikog kašlja itd.
Metode stadijuma RA
Približni RA na staklu
Deployed RA
(metoda volumena)
Reakcija koaglutinacije
Rasklopljeni RA na staklu (seroididentifikacija)
Reakcija aglutinacije na staklu. Dvije kapi specifičnog (adsorbiranog) seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Neadsorbirani serumi se prethodno razblažuju u omjeru 1:5 - 1:100. Kapi se moraju nanijeti na staklo tako da postoji razmak između njih. Kultura se temeljno melje na staklu petljom ili pipetom, a zatim se dodaje kapi izotonične otopine natrijum hlorida i jednoj od kapi seruma, miješajući svaku dok se ne formira homogena suspenzija. Kap seruma bez kulture je kontrola seruma.
Pažnja! Ne možete prenijeti kulturu iz seruma u kap izotonične otopine natrijum hlorida, koja služi kao kontrola antigena. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane prozirna, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje je kultura pomiješana sa serumom na pozadini bistre tekućine, rezultat reakcije se smatra pozitivnim.
Diagnostic Physiological
serum + rastvor kulture + kultura
Detaljna reakcija aglutinacije (volumenska metoda). Pripremaju se serijska, najčešće dvostruka, razrjeđenja seruma. Metoda se naziva volumetrijska. Za određivanje titra antitijela u krvnom serumu uzmite 6 epruveta. U prvu epruvetu sipajte 1 ml originalnog seruma u omjeru 1:50 i dodajte 1 ml fiziološkog rastvora u svih 6 epruveta koristeći graduisanu pipetu. Prva epruveta će dati razrjeđenje seruma od 1:100 sa zapreminom od 2 ml. Prebacite 1 ml iz prve epruvete u drugu epruvetu, gde razblaženje postaje 1:200. Zato napravite seriju serijskih razblaženja seruma u prvih 5 epruveta (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Iz pete epruvete sipajte 1 ml u rastvor za dezinfekciju. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma u svih 6 epruveta. Šesta epruveta je kontrola kulture, jer sadrži samo fiziološki rastvor i dijagnostikum.
|
Sastojci |
broj cijevi |
||||||
|
kontrola seruma |
kontrolu dijagnostička-kuma |
||||||
|
fiziološki | |||||||
|
Pacijentov serum | |||||||
|
razblaživanje 1:50 | |||||||
|
Diagnosticum (kapi) | |||||||
|
Razrjeđivanje seruma | |||||||
Takva kontrola je neophodna da bi se isključila spontana aglutinacija kulture. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 2 sata, a zatim ostave jedan dan na sobnoj temperaturi, nakon čega se bilježe rezultati reakcije aglutinacije. Prilikom izvođenja reakcije aglutinacije sa serumima djece u prvim mjesecima života, zbog funkcionalne inferiornosti stvaranja antitijela, potrebno je utvrditi niže titre antitijela, što se uzima u obzir pri razrjeđivanju seruma. Početno razrjeđenje seruma je 1:25. U prvoj epruveti dobije se razrjeđenje 1:50, zatim 1:100 itd.
Ako je rezultat reakcije pozitivan, epruvete pokazuju zaglavljene ćelije u obliku zrnaca ili pahuljica na pozadini bistre tečnosti. Aglutinat se postepeno taloži na dno u obliku "kišobrana", a tečnost iznad sedimenta postaje bistra. Kontrola antigena je jednolično mutna.
Na osnovu prirode sedimenta razlikuje se fino i krupnozrnasta (ljuskasta) aglutinacija. Pri radu sa O-serumom postiže se fino zrnasta aglutinacija. Krupnozrnast - kada pokretni mikrobi stupaju u interakciju sa flagelarnim H-serumom. Javlja se brže od sitnozrnog, a nastali sediment je vrlo labav i lako se lomi.
Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:
Sve ćelije su se slegle, tečnost u epruveti je potpuno prozirna. Rezultat reakcije je oštro pozitivan;
Taloga je manje, tečnost se ne bistri u potpunosti. Rezultat reakcije je pozitivan;
Taloga je još manje, tečnost je zamućenija. Rezultat reakcije je sumnjiv;
Na dnu epruvete je blagi talog, tečnost je mutna. Upitan rezultat reakcije;
Nema sedimenta, tečnost je jednolično zamućena, kao u kontroli antigena. Rezultat negativne reakcije
Aglutinacija je lijepljenje i taloženje mikroba ili drugih stanica pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). Grupe slijepljenih bakterija (ćelija) nazivaju se aglutinati. Za reakciju aglutinacije potrebne su sljedeće komponente:
1. Antitijela (aglutinini) koja se nalaze u serumu bolesne ili imune životinje.
2. Antigen - suspenzija živih ili ubijenih mikroba, crvenih krvnih zrnaca ili drugih ćelija.
3. Izotonični (0,9%) rastvor natrijum hlorida.
Reakcija aglutinacije za serodijagnostiku koristi se za trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija), brucelozu (reakcija Wright i Heddleson), tularemiju itd. Antitijelo je pacijentov serum, a antigen je poznati mikrob. Prilikom identifikacije mikroba ili drugih ćelija, njihova suspenzija se koristi kao antigen, a poznati imunološki serum se koristi kao antitijelo. Ova reakcija se široko koristi za dijagnosticiranje crijevnih infekcija, velikog kašlja itd.
Metode stadijuma RA
Približni RA na staklu
Deployed RA
(metoda volumena)
Reakcija koaglutinacije
Rasklopljeni RA na staklu (seroididentifikacija)
Reakcija aglutinacije na staklu. Dvije kapi specifičnog (adsorbiranog) seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Neadsorbirani serumi se prethodno razblažuju u omjeru 1:5 - 1:100. Kapi se moraju nanijeti na staklo tako da postoji razmak između njih. Kultura se temeljno melje na staklu petljom ili pipetom, a zatim se dodaje u kap izotonične otopine natrijum hlorida i u jednu od kapi seruma, miješajući svaku dok se ne formira homogena suspenzija. Kap seruma bez kulture je kontrola seruma.
Pažnja! Ne možete prenijeti kulturu iz seruma u kap izotonične otopine natrijum hlorida, koja služi kao kontrola antigena. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane prozirna, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje je kultura pomiješana sa serumom na pozadini bistre tekućine, rezultat reakcije se smatra pozitivnim.
 |
Diagnostic Physiological
serum + rastvor kulture + kultura
Detaljna reakcija aglutinacije (volumenska metoda). Pripremaju se serijska, najčešće dvostruka, razrjeđenja seruma. Metoda se naziva volumetrijska. Za određivanje titra antitijela u krvnom serumu uzmite 6 epruveta. U prvu epruvetu sipajte 1 ml originalnog seruma u omjeru 1:50 i dodajte 1 ml fiziološkog rastvora u svih 6 epruveta koristeći graduisanu pipetu. Prva epruveta će dati razrjeđenje seruma od 1:100 sa zapreminom od 2 ml. Prebacite 1 ml iz prve epruvete u drugu epruvetu, gde razblaženje postaje 1:200. Zato napravite seriju serijskih razblaženja seruma u prvih 5 epruveta (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Iz pete epruvete sipajte 1 ml u rastvor za dezinfekciju. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma u svih 6 epruveta. Šesta epruveta je kontrola kulture, jer sadrži samo fiziološki rastvor i dijagnostikum.
Takva kontrola je neophodna da bi se isključila spontana aglutinacija kulture. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 2 sata, a zatim ostave jedan dan na sobnoj temperaturi, nakon čega se bilježe rezultati reakcije aglutinacije. Prilikom izvođenja reakcije aglutinacije sa serumima djece u prvim mjesecima života, zbog funkcionalne inferiornosti stvaranja antitijela, potrebno je utvrditi niže titre antitijela, što se uzima u obzir pri razrjeđivanju seruma. Početno razrjeđenje seruma je 1:25. U prvoj epruveti dobije se razrjeđenje 1:50, zatim 1:100 itd.
Ako je rezultat reakcije pozitivan, epruvete pokazuju zaglavljene ćelije u obliku zrnaca ili pahuljica na pozadini bistre tečnosti. Aglutinat se postepeno taloži na dno u obliku "kišobrana", a tečnost iznad sedimenta postaje bistra. Kontrola antigena je jednolično mutna.
Na osnovu prirode sedimenta razlikuje se fino i krupnozrnasta (ljuskasta) aglutinacija. Pri radu sa O-serumom postiže se fino zrnasta aglutinacija. Krupnozrnast - kada pokretni mikrobi stupaju u interakciju sa flagelarnim H-serumom. Javlja se brže od sitnozrnog, a nastali sediment je vrlo labav i lako se lomi.
Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:
Sve ćelije su se slegle, tečnost u epruveti je potpuno prozirna. Rezultat reakcije je oštro pozitivan;
Taloga je manje, tečnost se ne bistri u potpunosti. Rezultat reakcije je pozitivan;
Taloga je još manje, tečnost je zamućenija. Rezultat reakcije je sumnjiv;
Na dnu epruvete je blagi talog, tečnost je mutna. Upitan rezultat reakcije;
Nema sedimenta, tečnost je jednolično zamućena, kao u kontroli antigena. Rezultat negativne reakcije
1.1. REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)
REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)
Zbog svoje specifičnosti, lakoće izvođenja i demonstrativnosti, reakcija aglutinacije je postala široko rasprostranjena u mikrobiološkoj praksi za dijagnostiku mnogih zaraznih bolesti.
Reakcija aglutinacije zasniva se na specifičnosti interakcije antitijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama (aglutinogeni). Kao rezultat ove interakcije nastaju čestice i aglomerati koji se talože (aglutiniraju) u obliku pahuljica.
Reakcija aglutinacije može uključivati i žive i ubijene bakterije, spirohete, gljive, protozoe, rikecije, kao i crvena krvna zrnca i druge stanice. Reakcija se odvija u dvije faze: prva (nevidljiva) specifična, kombinacija antigena i antitela, druga (vidljiva) nespecifična, lepljenje antigena, tj. formiranje aglutinata.
Aglutinat nastaje kada se jedan aktivni centar dvovalentnog antitijela spoji sa determinantnom grupom antigena. Reakcija aglutinacije, kao i svaka serološka reakcija, nastaje u prisustvu elektrolita.
Izvana, manifestacija pozitivne reakcije aglutinacije ima dvostruki karakter. Kod flageliranih mikroba koji imaju samo somatski O2 antigen, same mikrobne ćelije se direktno spajaju. Ova aglutinacija se naziva sitnozrnasta. Javlja se u roku od 18 22 sata. v
Flagelati mikrobi imaju dva antigena: somatski O2 antigen i flagelarni H2 antigen. Ako su ćelije međusobno zalijepljene flagelama, formiraju se velike, labave ljuspice i ova reakcija aglutinacije naziva se krupnozrnasta. Javlja se u roku od 24 sata.
Reakcija aglutinacije se može izvesti kako u svrhu kvalitativnog i kvantitativnog određivanja specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta, tako i u svrhu određivanja vrste izoliranog patogena. v
Reakcija aglutinacije može se izvesti i u proširenoj verziji, koja vam omogućava rad sa serumom razrijeđenim do dijagnostičkog titra, i u verziji indikativne reakcije, koja u principu omogućava otkrivanje specifičnih antitijela ili određivanje vrste patogena.
Prilikom izvođenja detaljne reakcije aglutinacije, radi otkrivanja specifičnih antitijela u krvnom serumu ispitanika, test serum se uzima u razrjeđenju 1:50 ili 1:100. To je zbog činjenice da normalna antitijela mogu biti prisutna u vrlo visokim koncentracijama u cijelom ili malo razrijeđenom serumu, te tada rezultati reakcije mogu biti netačni. Materijal koji se testira u ovoj verziji reakcije je krv pacijenta.
Krv se uzima na prazan želudac ili ne ranije od 6 sati nakon obroka (inače u krvnom serumu mogu biti kapljice masti koje ga čine mutnim i neprikladnim za istraživanje). Krvni serum pacijenta se obično uzima u drugoj nedelji bolesti, uzimajući sterilno 3 × 4 ml krvi iz kubitalne vene (do tog vremena je koncentrisana maksimalna količina specifičnih antitela). Kao poznati antigen koristi se dijagnostikum pripremljen od ubijenih, ali ne uništenih mikrobnih ćelija određene vrste sa specifičnom antigenskom strukturom.
Prilikom izvođenja detaljne reakcije aglutinacije u cilju određivanja vrste i vrste patogena, antigen je živi patogen izoliran iz materijala koji se proučava. Poznata su antitijela sadržana u imuno dijagnostičkom serumu. v
Imunološki dijagnostički serum se dobija iz krvi vakcinisanog kunića. Nakon određivanja titra (maksimalno razrjeđenje pri kojem se otkrivaju antitijela), dijagnostički serum se sipa u ampule uz dodatak konzervansa. Ovaj serum se koristi za identifikaciju po antigenskoj strukturi izolovanog patogena.
OPCIJE REAKCIJE AGLUTINACIJE
Ove reakcije uključuju antigene u obliku čestica (mikrobne ćelije, crvena krvna zrnca i drugi korpuskularni antigeni), koje se spajaju antitijelima i talože.
Za izvođenje reakcije aglutinacije (RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen); 2) antitelo (aglutinin) i 3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).
ORIJENTATIVNA (PLOČA) REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)
Indikativni, ili pločasti, RA se stavlja na stakalce na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, pomoću Pasteurove pipete odvojeno nanesite kap seruma u razrjeđenju 1:10 1:20 i kontrolnu kap izotonične otopine natrijum hlorida na staklo. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obje bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir vizuelno nakon nekoliko minuta, ponekad pomoću lupe (x5). Kod pozitivnog RA uočava se pojava velikih i malih pahuljica u kapi seruma sa negativnim, serum ostaje jednolično zamućen.
INDIREKTNA (PASIVNA) REAKCIJA HEMAGLUTINACIJE (RNGA, RPGA)
Reakcija se izvodi: 1) za otkrivanje polisaharida, proteina, ekstrakata bakterija i drugih visoko dispergiranih supstanci, rikecija i virusa, čiji se kompleksi sa aglutininima ne mogu vidjeti kod konvencionalnog RA, ili 2) za otkrivanje antitijela u serumu pacijenata za ove visoko raspršene supstance i najmanji mikroorganizmi.
Indirektna, ili pasivna, aglutinacija se podrazumijeva kao reakcija u kojoj antitijela stupaju u interakciju s antigenima prethodno adsorbiranim na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barij oksid itd. ili crvena krvna zrnca ovaca, ljudska krvna grupa I(0)).
U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA), crvena krvna zrnca se koriste kao nosač. Crvena krvna zrnca napunjena antigenom se lijepe zajedno u prisustvu specifičnih antitijela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPGA kao dijagnostikum eritrocita za detekciju antitijela (serodijagnostika). Ako su crvena krvna zrnca napunjena antitijelima (dijagnostikum antitijela eritrocita), mogu se koristiti za otkrivanje antigena.
Staging. Serija serijskih razblaženja seruma priprema se u jamicama polistirenskih ploča. Dodajte 0,5 ml očigledno pozitivnog seruma u pretposljednju jažicu i 0,5 ml fiziološkog rastvora (kontrole) u posljednju. Zatim dodajte 0,1 ml razrijeđenog eritrocitnog dijagnostikuma u sve jažice, protresite i stavite u termostat na 2 sata v
Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, crvena krvna zrnca se talože na dnu rupe u obliku ravnog sloja stanica sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran, u negativnom slučaju, talože se u obliku gumba ili prstena). .
1.2. REAKCIJA NEUTRALIZACIJE. LIZA,
OPSONOFAGOCITNA REAKCIJA, REAKCIJA PREOSJETLJIVOSTI
REAKCIJA NEUTRALIZACIJE EGZOTOKSINA SA ANTITOKSINOM (RN)
Reakcija se temelji na sposobnosti antitoksičnog seruma da neutralizira djelovanje egzotoksina. Koristi se za titraciju antitoksičnih seruma i određivanje egzotoksina.
Prilikom titriranja seruma, određena doza odgovarajućeg toksina se dodaje različitim razrjeđenjima antitoksičnog seruma. Kada je antigen potpuno neutraliziran i nema nepotrošenih antitijela, dolazi do početne flokulacije. Reakcija flokulacije može se koristiti ne samo za titraciju seruma (na primjer, difterija), već i za titraciju toksina i toksoida. Reakcija neutralizacije toksina antitoksinom je od velike praktične važnosti kao metoda za određivanje aktivnosti antitoksičnih terapijskih seruma. Antigen u ovoj reakciji je pravi egzotoksin.
Jačina antitoksičnog seruma određena je konvencionalnim jedinicama AE.
1 AE botulinum seruma njegova količina neutralizira 1000 DLM botulinum toksina. Reakcija neutralizacije za određivanje vrste ili vrste egzotoksina (za dijagnozu tetanusa, botulizma, difterije itd.) može se provesti in vitro (prema Ramonu), a kod određivanja toksičnosti mikrobnih stanica - u gelu ( prema Ouchterlonyju).
Reakcija lize (RL)
Jedno od zaštitnih svojstava imunološkog seruma je njegova sposobnost da otapa mikrobe ili ćelijske elemente koji ulaze u tijelo.
Specifična antitijela koja uzrokuju otapanje stanica (lizu) nazivaju se lizini. Ovisno o prirodi antigena, mogu biti bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini itd.
Lizini pokazuju svoj efekat samo u prisustvu dodatnog faktora komplementa. Komplement se, kao faktor nespecifičnog humoralnog imuniteta, nalazi u gotovo svim tjelesnim tečnostima, osim u likvoru i tečnosti prednje očne komore. Prilično visok i konstantan sadržaj komplementa bilježi se u ljudskom krvnom serumu, a dosta ga u krvnom serumu zamoraca. Kod ostalih sisara sadržaj komplementa u krvnom serumu je drugačiji.
Komplement je složen sistem serumskih proteina. Nestabilan je i kolabira na 55 stepeni 30 minuta. Na sobnoj temperaturi komplement se uništava u roku od dva sata. Veoma osjetljiv na dugotrajno mućkanje, kiseline i ultraljubičaste zrake. Međutim, komplement se čuva dugo (do šest mjeseci) u osušenom stanju na niskim temperaturama. Komplement potiče lizu mikrobnih stanica i crvenih krvnih stanica.
Pravi se razlika između reakcija bakteriolize i hemolize.
Suština reakcije bakteriolize je da kada se specifični imunološki serum spoji sa odgovarajućim homolognim živim mikrobnim stanicama u prisustvu komplementa, dolazi do mikrobne lize.
Reakcija hemolize je da kada su eritrociti izloženi specifičnom serumu koji je na njih imun (hemolitički) u prisustvu komplementa, uočava se otapanje eritrocita, tj. hemoliza.
Reakcija hemolize u laboratorijskoj praksi koristi se za određivanje raspona komplementa, kao i za uzimanje u obzir rezultata dijagnostičkih reakcija fiksacije komplementa. Titar komplementa je njegova najmanja količina, koja uzrokuje lizu crvenih krvnih zrnaca u roku od 30 minuta u hemolitičkom sistemu u zapremini od 2,5 ml. Reakcija lize, kao i sve serološke reakcije, odvija se u prisustvu elektrolita.
REAKCIJE PREOSJETLJIVOSTI (ALERGIČNE)
Određeni oblici antigena, pri ponovljenom kontaktu s tijelom, mogu izazvati reakciju koja je po svojoj osnovi specifična, ali uključuje nespecifične ćelijske i molekularne faktore akutnog upalnog odgovora. Postoje dva poznata oblika preosjetljivosti: preosjetljivost neposrednog tipa (IHT) i hipersenzitivnost odgođenog tipa (DTH). Prva vrsta reakcije javlja se uz sudjelovanje antitijela, a reakcija se razvija najkasnije 2 sata nakon ponovnog kontakta s alergenom. Drugi tip se ostvaruje uz pomoć upalnih T stanica (Tgc) kao glavnih efektora reakcije, osiguravajući nakupljanje makrofaga u području upale, a reakcija se manifestira nakon 6-8 sati i kasnije.
Nastanku reakcije preosetljivosti prethodi susret sa antigenom i pojava senzibilizacije, tj. pojava antitijela, aktivno senzibiliziranih limfocita i pasivno senzibiliziranih citofilnih antitijela drugih leukocita (makrofaga, granulocita).
Reakcije preosjetljivosti imaju tri faze razvoja: imunološku; patohemijski; patofiziološki.
U prvoj, specifičnoj fazi, alergen stupa u interakciju s antitijelima i (ili) senzibiliziranim stanicama. U drugoj fazi se iz aktiviranih ćelija oslobađaju biološki aktivne supstance. Oslobođeni medijatori (histamin, serotonin, leukotrieni, bradikinin itd.) izazivaju različite periferne efekte karakteristične za odgovarajući tip reakcije treće faze.
Reakcije preosjetljivosti tipa 4
Reakcije ovog tipa uzrokovane su patogenim međućelijskim interakcijama senzibiliziranih T pomoćnih stanica, citotoksičnih T limfocita (T ćelija ubica) i aktiviranih ćelija mononuklearnog fagocitnog sistema, uzrokovanih produženom stimulacijom imunog sistema bakterijskim antigenima, u kojima postoji relativna insuficijencija imunološkog sistema organizma da eliminiše bakterijske patogene iz unutrašnjeg okruženja zaraznih bolesti. Ove reakcije preosjetljivosti uzrokuju tuberkulozne plućne šupljine, njihovu kazeoznu nekrozu i opću intoksikaciju kod bolesnika s tuberkulozom. Kožna granulomatoza kod tuberkuloze i lepre u morfopatogenetskom smislu je uglavnom sastavljena od reakcija preosjetljivosti četvrtog tipa.
Najpoznatiji primjer četvrte vrste reakcije preosjetljivosti je Mantouxova reakcija, koja se razvija na mjestu intradermalne injekcije tuberkulina pacijentu čije su tijelo i sistem senzibilizirani na mikobakterijske antigene. Kao rezultat reakcije formira se gusta hiperemična papula s nekrozom u centru, koja se pojavljuje samo nekoliko sati (polako) nakon intradermalne injekcije tuberkulina. Formiranje papule počinje oslobađanjem mononuklearnih fagocita cirkulirajuće krvi iz vaskularnog kreveta u međućelijske prostore. Istovremeno počinje emigracija polimorfonuklearnih ćelija iz vaskularnog korita. Tada se infiltracija neutrofilima smanjuje, a infiltrat počinje da se sastoji pretežno od limfocita i mononuklearnih fagocita. Ovo se razlikuje od Mantouxove reakcije od Arthusove reakcije, u kojoj se pretežno polimorfonuklearni leukociti akumuliraju na mjestu lezije.
Kod reakcija preosjetljivosti tipa 4, dugotrajna stimulacija senzibiliziranih limfocita antigenima dovodi, na mjestima patoloških promjena tkiva, do patološki intenzivnog i produženog oslobađanja citokina od strane T pomoćnih stanica. Intenzivno oslobađanje citokina na lokusima oštećenja tkiva uzrokuje hiperaktivaciju ćelija mononuklearnog fagocitnog sistema koji se tamo nalazi, od kojih mnoge u hiperaktiviranom stanju formiraju niti epiteloidnih ćelija, a neke se spajaju jedna s drugom u gigantske ćelije. Makrofagi, na čijoj su površini izloženi bakterijski i virusni antigeni, mogu se uništiti djelovanjem Tkillera (prirodnih ubica).
Četvrti tip reakcije preosjetljivosti inducira se prepoznavanjem stranog bakterijskog antigena od strane T pomoćnih stanica koje su senzibilizirane na njega. Neophodan uslov za prepoznavanje je interakcija induktora sa antigenima izloženim na površini ćelija koje predstavljaju antigen nakon endocitoze i obrade stranih imunogena mononuklearnim fagocitima. Drugi neophodan uslov je izlaganje antigenima u kombinaciji sa molekulima klase I iz glavnog kompleksa histokompatibilnosti. Nakon prepoznavanja antigena, senzibilizirane pomoćne stanice oslobađaju citokine i, posebno, interleukin2, koji aktivira prirodne stanice ubice i mononuklearne fagocite. Aktivirani mononuklearni fagociti oslobađaju proteolitičke enzime i slobodne kisikove radikale, koji oštećuju tkivo.
Kožni alergijski testovi su testovi za određivanje senzibilizacije organizma na alergene, utvrđivanje njegove infekcije, na primjer, tuberkuloze, bruceloze, razine kolektivnog imuniteta, na primjer, na tularemiju. Na osnovu mesta primene alergena razlikuju se: 1) kožni testovi; 2) skarifikacija; 3) intradermalno; 4) potkožni. Klinička reakcija na alergen tijekom kožnog alergijskog testa dijeli se na lokalnu, opću i žarišnu, te trenutnu i odgođenu.
Lokalne reakcije medijatorskog tipa GNT javljaju se nakon 520 minuta, izražene su u obliku eritema i plikova, nestaju nakon nekoliko sati, a procjenjuju se plus metodom po veličini eritema mjerene u mm. Lokalne reakcije HNL-a se javljaju u roku od 24-48 sati, traju dugo, pojavljuju se u obliku infiltrata, ponekad sa nekrozom u centru, a procjenjuju se po veličini infiltrata u mm, također primjenom plus sistema. Kod citotoksičnih i imunokompleksnih tipova HNT, hiperemija i infiltracija se uočavaju nakon 3-4 sata, dostižu maksimum za 6-8 sati i nestaju nakon otprilike jednog dana. Ponekad se uočavaju kombinovane reakcije.
1.3. REAKCIJA FIKSIRANJA KOMPLEMENTA (FFR)
Ova reakcija se koristi u laboratorijskim testovima za otkrivanje antitijela u krvnom serumu za različite infekcije, kao i za identifikaciju patogena po njegovoj antigenskoj strukturi.
Reakcija fiksacije komplementa je složena serološka reakcija i vrlo je osjetljiva i specifična.
Karakteristika ove reakcije je da se promjena antigena tokom njegove interakcije sa specifičnim antitijelima događa samo u prisustvu komplementa. Komplement se adsorbuje samo na kompleksu "antitelo antigen". Kompleks „antitela antigena“ nastaje samo ako postoji afinitet između antigena i antitela u serumu.
Adsorpcija komplementa na kompleksu "antigen antitela" može imati različite efekte na sudbinu antigena u zavisnosti od njegovih karakteristika.
Neki od antigena pod ovim uslovima prolaze kroz oštre morfološke promene, uključujući otapanje (hemoliza, Isaev-Pfeifferov fenomen, citolitičko delovanje). Drugi mijenjaju brzinu kretanja (imobilizacija treponema). Drugi umiru bez iznenadnih destruktivnih promjena (baktericidno ili citotoksično djelovanje). Konačno, adsorpcija komplementa možda neće biti praćena promjenama antigena koje su lako uočljive.
Prema RSC mehanizmu, odvija se u dvije faze:
- Prva faza je formiranje kompleksa “antigen antitijela” i adsorpcija na ovom kompleksu komplementa. Rezultat faze nije vizuelno vidljiv (interakcija antigena i antitela uz obavezno učešće komplementa).
- Druga faza je promena antigena pod uticajem specifičnih antitela u prisustvu komplementa. Rezultat faze može biti vidljiv vizualno ili ne vidljiv (detekcija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sistema (crvena krvna zrnca ovaca i hemolitički serum).
Uništavanje crvenih krvnih zrnaca hemolitičkim serumom događa se samo ako se hemolitičkom sistemu doda komplement. Ako je komplement prethodno bio adsorbiran na kompleksu antigen-antitijelo, tada ne dolazi do hemolize eritrocita.
Rezultat eksperimenta se procjenjuje primjenom prisustva ili odsustva hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom kada je hemoliza potpuno odgođena, kada je tečnost u epruveti bezbojna i crvena krvna zrnca se talože na dno, negativnom kada su crvena krvna zrnca potpuno lizirana, kada je tečnost intenzivno obojena (“lak” krv). Stepen kašnjenja hemolize se procjenjuje ovisno o intenzitetu boje tekućine i veličini sedimenta crvenih krvnih zrnaca na dnu (++++, +++, ++, +).
U slučaju kada promjene u antigenu ostaju nedostupne za vizualno promatranje, potrebno je koristiti drugi sistem, koji djeluje kao indikator, omogućavajući procjenu stanja komplementa i izvođenje zaključka o rezultatu reakcije.
Ovaj indikatorski sistem predstavljaju komponente reakcije hemolize, koje uključuju ovčje eritrocite i hemolitički serum, koji sadrži specifična antitijela na eritrocite (hemolizine), ali ne sadrži komplement. Ovaj indikatorski sistem se dodaje u epruvete sat vremena nakon postavljanja glavnog RSC-a. Ako je reakcija fiksacije komplementa pozitivna, tada se formira kompleks antigena antitijela, koji adsorbira komplement na sebe. Pošto se komplement koristi u količini potrebnoj za samo jednu reakciju, a do lize eritrocita može doći samo u prisustvu komplementa, onda kada se on adsorbuje na kompleksu “antigen antitela” dolazi do lize eritrocita u hemolitičkom (indikatorskom) sistemu. se ne dešavaju. Ako je reakcija fiksacije komplementa negativna, kompleks “antigen antitijela” se ne formira, komplement ostaje slobodan, a dodavanjem hemolitičkog sistema dolazi do lize eritrocita.
1.4. DNK SONDE. POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA (PCR),
IMUNOENZIMSKA METODA (ELISA), METODA FLUORESCIRANJA ANTITIJELA (FFA)
METODE ISPITIVANJA GENOM
Intenzivan razvoj molekularne biologije i stvaranje savršene metodološke osnove za genetička istraživanja činili su osnovu genetskog inženjeringa. U području dijagnostike pojavio se i ubrzano se razvija smjer određivanja specifičnih nukleotidnih sekvenci DNK i RNK, tzv. gensko sondiranje. Takve tehnike se zasnivaju na sposobnosti nukleinskih kiselina da se hibridizuju i formiraju dvolančane strukture zbog interakcije komplementarnih nukleotida (AT, GC).
Za određivanje željene DNK (ili RNK) sekvence posebno se kreira takozvana polinukleotidna sonda sa specifičnom baznom sekvencom. U njegov sastav uvedena je posebna oznaka koja omogućava identifikaciju formiranja kompleksa.
Iako se gensko sondiranje ne može klasifikovati kao metoda imunohemijske analize, njegov osnovni princip (interakcija komplementarnih struktura) se metodički sprovodi na isti način kao indikatorske metode imunodijagnostike. Osim toga, metode genskog sondiranja omogućavaju dopunu informacija o infektivnom agensu u odsustvu njegove fenotipske ekspresije (virusi ugrađeni u genom, "tihi" geni).
Da bi se izvršila DNK analiza, uzorak se denaturira kako bi se dobile jednolančane strukture s kojima reagiraju molekuli DNK ili RNK sonde. Za pripremu sondi koriste se ili različiti dijelovi DNK (ili RNK) izolirani iz prirodnog izvora (na primjer, određeni mikroorganizam), obično predstavljeni u obliku genetskih sekvenci u vektorskim plazmidima, ili kemijski sintetizirani oligonukleotidi. U nekim slučajevima se kao sonda koriste preparati genomske DNK hidrolizovane u fragmente, ponekad preparati RNK, a posebno često ribosomska RNK. Kao oznaka koriste se isti indikatori kao i u raznim vrstama imunohemijskih analiza: radioaktivni izotopi, fluoresceini, biotop (sa daljim razvojem kompleksa avidin-enzim) itd.
Redoslijed analize određen je svojstvima dostupne sonde
Trenutno se sve više koriste komercijalni kompleti koji sadrže sve potrebne sastojke.
U većini slučajeva, postupak analize može se podijeliti u sljedeće faze: priprema uzorka (uključujući ekstrakciju i denaturaciju DNK), fiksiranje uzorka na nosač (najčešće filter od polimerne membrane), predhibridizacija, sama hibridizacija, ispiranje nevezanih proizvoda, detekcija . U nedostatku standardnog preparata DNK ili RNA sonde, prvo se dobije i označi.
Da bi se pripremio uzorak, možda će biti potrebno preliminarno „uzgojiti“ testni materijal kako bi se identificirale pojedinačne kolonije bakterija ili povećala koncentracija virusa u ćelijskoj kulturi. Također se provodi direktna analiza uzoraka krvnog seruma, urina, krvnih stanica ili pune krvi na prisustvo infektivnog agensa. Da bi se nukleinske kiseline oslobodile iz staničnih struktura, provodi se ćelijska liza, au nekim slučajevima preparat DNK se pročišćava fenolom.
Denaturacija DNK, odnosno njen prelazak u jednolančani oblik, nastaje kada se tretira alkalijom. Uzorak nukleinske kiseline se zatim fiksira na podlogu, nitroceluloznu ili najlonsku membranu, obično inkubacijom od 10 minuta do 4 sata na 80°C u vakuumu. Nadalje, u procesu prehibridizacije, postiže se inaktivacija slobodnih veznih mjesta kako bi se smanjila nespecifična interakcija sonde sa membranom. Proces hibridizacije traje od 2 do 20 sati, ovisno o koncentraciji DNK u uzorku, koncentraciji korištene sonde i njenoj veličini.
Nakon što se hibridizacija završi i nevezani proizvodi se isperu, detektuje se formirani kompleks. Ako sonda sadrži radioaktivnu oznaku, tada se za demonstraciju reakcije membrana izlaže fotografskom filmu (autoradiografija). Za ostale oznake koriste se odgovarajuće procedure.
Najperspektivnije je nabaviti neradioaktivne (tzv. hladne) sonde. Na istoj osnovi razvija se tehnika hibridizacije koja omogućava utvrđivanje prisustva patogena u preparatima preseka i punkcijama tkiva, što je posebno važno u patomorfološkoj analizi (in situ hibridizacija).
Značajan korak u razvoju metoda genskog sondiranja bila je upotreba reakcije amplifikacije polimeraze (PCR). Ovaj pristup omogućava povećanje koncentracije specifične (prethodno poznate) sekvence DNK u uzorku sintetiziranjem više kopija in vitro. Da bi se izvela reakcija, ispitivanom uzorku DNK dodaje se preparat enzima DNK polimeraze, višak deoksinukleotida za sintezu i tzv. prajmeri - dvije vrste oligonukleotida veličine 2025 baza koje odgovaraju terminalnim dijelovima DNK sekvenca od interesa. Jedan od prajmera treba da bude kopija početka regiona za čitanje kodirajućeg lanca DNK u smeru čitanja 53, a drugi treba da bude kopija suprotnog kraja nekodirajućeg lanca. Zatim, sa svakim ciklusom reakcije polimeraze, broj kopija DNK se udvostručuje.
Da bi se postiglo vezivanje prajmera, neophodna je denaturacija (topljenje) DNK na 94°C, nakon čega sledi dovođenje smeše na 40-55°C.
Za izvođenje reakcije, programirani inkubatori za mikrouzorke su dizajnirani da lako mijenjaju promjene optimalne temperature za svaku fazu reakcije.
Reakcija amplifikacije može značajno povećati osjetljivost analize tokom sondiranja gena, što je posebno važno pri niskim koncentracijama infektivnog agensa.
Jedna od značajnih prednosti sondiranja gena sa amplifikacijom je mogućnost proučavanja submikroskopskih količina patološkog materijala.
Još jedna karakteristika metode, važnija za analizu infektivnog materijala, je mogućnost identifikacije skrivenih (tihih) gena. Metode povezane sa upotrebom genskog sondiranja sigurno će se sve više uvoditi u praksu dijagnosticiranja zaraznih bolesti kako budu sve jednostavnije i jeftinije.
ELISA i RIF metode su uglavnom kvalitativne ili polu-kvantitativne prirode. Pri vrlo niskim koncentracijama komponenti, formiranje kompleksa antigen antitijela ne može se otkriti ni vizualno ni jednostavnim instrumentalnim sredstvima. Indikacija kompleksa antigena antitijela u takvim slučajevima može se provesti ako se u jednu od inicijalnih komponenti antigena ili antitijela unese oznaka, koja se lako može detektovati u koncentracijama usporedivim sa utvrđenom koncentracijom analita.
Radioaktivni izotopi (na primjer, 125I), fluorescentne tvari i enzimi mogu se koristiti kao oznake.
Ovisno o korištenoj etiketi, razlikuju se radioimunoesej (RIA), fluorescentni imunološki (FIA), enzimski imunosorbentni test (ELISA) itd. Posljednjih godina ELISA je dobila široku praktičnu upotrebu, što je povezano s mogućnošću kvantitativnog određivanja. , visoka osjetljivost, specifičnost i automatizacija računovodstva.
Metode enzimskog imunoeseja su grupa metoda koje omogućavaju detekciju kompleksa antigen-antitijelo korištenjem supstrata koji enzim cijepa i proizvodi boju.
Suština metode je da se kombinuju komponente reakcije antigena antitela sa izmerenom oznakom enzima. Antigen ili antitijelo koje reaguje označeno je enzimom. Na osnovu transformacije supstrata pod dejstvom enzima može se suditi o količini interakcijske komponente reakcije antigen antitela. Enzim u ovom slučaju služi kao marker imunološke reakcije i omogućava da se ona posmatra vizuelno ili instrumentalno.
Enzimi su vrlo zgodne oznake jer im njihova katalitička svojstva omogućavaju da djeluju kao pojačivači, budući da jedan molekul enzima može potaknuti stvaranje više od 1 × 105 molekula proizvoda katalitičke reakcije u minuti. Potrebno je odabrati enzim koji dugo zadržava svoju katalitičku aktivnost, ne gubi je pri vezivanju za antigen ili antitijelo i ima visoku specifičnost u odnosu na supstrat.
Glavne metode za proizvodnju enzimom obeleženih antitela ili antigena i konjugata su: hemijski, imunološki i genetski inženjering. Enzimi koji se najčešće koriste za ELISA test su peroksidaza hrena, alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.
Za otkrivanje enzimske aktivnosti u kompleksu antigen-antitijelo u svrhu vizualnog i instrumentalnog snimanja reakcije koriste se hromogeni supstrati čiji rastvori, u početku bezbojni, tokom enzimske reakcije dobijaju boju čiji je intenzitet proporcionalan količini. enzima. Tako se za otkrivanje aktivnosti peroksidaze hrena u čvrstoj fazi ELISA kao supstrat koriste 5-aminosalicilna kiselina koja daje intenzivnu smeđu boju i orto-fenilendiamin koji daje narandžasto-žutu boju. Za otkrivanje aktivnosti alkalne fosfataze i β-galatozidaze koriste se nitrofenilfosfati i nitrofenilgalaktozidi.
Rezultat reakcije u formiranju obojenog proizvoda određuje se vizualno ili pomoću spektrofotometra koji mjeri apsorpciju svjetlosti određene valne dužine.
Postoji mnogo opcija za izvođenje ELISA. Postoje homogene i heterogene opcije.
Prema načinu proizvodnje razlikuju se kompetitivne i nekonkurentne ELISA metode. Ako je u prvoj fazi samo analizirano jedinjenje i njegovi odgovarajući centri vezivanja (antigen i specifična antitela) prisutni u sistemu, onda je metoda nekonkurentna. Ako su u prvoj fazi prisutni analizirano jedinjenje (antigen) i njegov analog (antigen obeležen enzimom), koji se međusobno nadmeću za vezivanje za specifične centre vezivanja (antitela) kojih nema dovoljno, tada je metoda konkurentna. U ovom slučaju, što više test antigena sadrži otopina, to je manji broj vezanih obilježenih antigena.
METODA FLUORESCIRANJA ANTITELA (MFA) ili IMUNOLUORESCENTNE REAKCIJE (RIF)
Metoda imunofluorescencije je metoda izbora za brzo otkrivanje i identifikaciju nepoznatog mikroorganizma u ispitivanom materijalu.
Ag + AT + elektrolit = kompleks koji svijetli u UV zracima
Mikrobni serum označen fluorohromom
Boja koja se često koristi je fluorescein izotiocijanat FITC
Prilikom proučavanja ove metode koristi se fluorescentni mikroskop.
Staging RIF
30 μl FITC-obilježenog rastvora antitijela se nanosi na bris.
Stavite čašu u vlažnu komoru i držite je na sobnoj temperaturi 20-25 minuta, ili u termostatu na 37°C 15 minuta.
Operite čašu u tekućoj vodi iz slavine 2 minute, isperite destilovanom vodom i osušite na zraku.
Kap tečnosti za montažu nanosi se na osušeni razmaz, razmaz se prekriva pokrovnim stakalcem i mikroskopira pomoću fluorescentnog mikroskopa ili fluorescentnog nastavka na konvencionalnom optičkom mikroskopu.
br. 29 Reakcija aglutinacije. Komponente, mehanizam, metode ugradnje. Aplikacija.
Reakcija aglutinacije- jednostavna reakcija u kojoj antitela vezuju korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge ćelije, netopive čestice sa adsorbovanim antigenima na njima, kao i makromolekularne agregate). Javlja se u prisustvu elektrolita, na primjer, kada se doda izotonični rastvor natrijum hlorida.
Koriste se različite varijante reakcije aglutinacije: ekstenzivna, indikativna, indirektna itd. Reakcija aglutinacije se manifestuje formiranjem pahuljica ili sedimenta (ćelije „zalepljene” antitelima koje imaju dva ili više centara za vezivanje antigena – slika 13.1). RA se koristi za:
1) određivanja antitela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, s brucelozom (reakcija Wright, Heddelson), tifusnom groznicom i paratifusnom groznicom (Vidalova reakcija) i drugim zaraznim bolestima;
2) određivanje patogena izolovan od pacijenta;
3) određivanje krvnih grupa korištenjem monoklonskih antitijela protiv aloantigena eritrocita.
Određivanje antitijela kod pacijenta izvršiti detaljnu reakciju aglutinacije: Dijagnostikum (suspenzija ubijenih mikroba) dodaje se u razrjeđenja krvnog seruma pacijenta, a nakon nekoliko sati inkubacije na 37 °C, bilježi se najveće razrjeđenje seruma (titar seruma) pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. formirana.
Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i antitijela. Primjer su posebnosti interakcije dijagnostikuma (O- i H-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije s O-diagnosticumom (bakterije ubijene toplinom, zadržavajući termostabilni O-antigen) se javlja u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije sa H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i teče brže. Ako je potrebno utvrditi patogen izolovan od pacijenta, staviti indikativna reakcija aglutinacije, uz pomoć dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), odnosno vrši se serotipizacija patogena. Indikativna reakcija se izvodi na stakalcu. Čista kultura patogena izolovanog od pacijenta dodaje se kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20. U blizini je postavljena kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijum hlorida. Kada se u kapi sa serumom i mikrobima pojavi flokulantni sediment, vrši se detaljna reakcija aglutinacije u epruvetama sa sve većim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma u koje se dodaju 2-3 kapi suspenzije patogena. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stepenom bistrine tečnosti. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Pri tome se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnim rastvorom natrijum hlorida treba da bude providan, suspenzija mikroba u istom rastvoru treba da bude jednolično zamućena, bez sedimenta.
Različite srodne bakterije mogu biti aglutinirane istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, koji
otežava njihovu identifikaciju. Stoga koriste adsorbirane aglutinirajuće serume iz kojih su uklonjene
unakrsna reakcija antitijela adsorpcijom na srodne bakterije. Antitela su sačuvana u takvim serumima,
specifično samo za datu bakteriju.
