Гепатиты выделяют в отдельную группу воспалительных заболеваний печени. Они могут иметь разную этиологию и форму. При первых подозрениях на такие заболевания врач назначает соответствующие анализы. Но так как патологии рознятся своей природой, то и методы обнаружения вируса тоже отличаются.
Чаще всего фиксируются вирусы гепатитов А, В, С, D, E, F, G, которые вызваны количественным вирусным инфицированием. Помимо этого, показатели заболевания могут наблюдаться при желтой лихорадке, паротите, болезни Эпштейна - Барра, герпесе, краснухе, цитомегаловирусах, лихорадке Ласса, СПИДе.
Ингибирование гемагглютинации
Этот метод долгое время считался эталонным методом. Он прост, чувствителен и воспроизводим. Это метод, подходящий для исследований серопозитивности. Однако этот метод не идентифицирует серотип, и перекрестные реакции с другими флавивирусами ограничивают его использование. В общем, довольно редко бывает две последовательные сыворотки, и диагноз часто ретроспективен.
Реакция фиксации комплемента
Принцип этой методики одинаковый для всех вирусов. Поэтому интерес этого метода относительно.Иммуноферментный анализ на гепатит
Наиболее часто используемым методом серонутрализации является уменьшение бляшек лизиса, вызванных вирусом. По мнению авторов, ингибирование процента лизисных интервалов установлено на уровне 50% или 90%. 90% ингибирование обычно эквивалентно первичной инфекции, тогда как ингибирование 50-70% больше связано с вторичной лихорадкой. Кроме того, он позволяет определить серотип вируса во время первичной инфекции. Этот чувствительный и специфический метод имеет важное значение для оценки эффективности вакцины.
Бактериальные причины развития патологий наблюдаются при наличии сифилиса, лептоспирозе, токсические – при алкоголизме, лекарственной, химической интоксикации. Также существуют гепатиты, вызванные лучевой болезнью и аутоиммунными патологиями. Каждый из этих видов патологии требует индивидуального подхода в лечении.
Поэтому при наличии у больного клинических симптомов заболевания назначается исследование крови на маркеры различных типов заболеваний.
Тем не менее, это дорого, долго, трудно реализовать и требует контроля над клеточной культурой. Поэтому у них преобладающее место в рутине, даже если они не дают диагноз достоверности и не все данные, необходимые для эпидемиологического надзора за вирусом. Разработаны два принципа: косвенные методы и иммунозахват.
Таблица 1 Основные коммерческие наборы, используемые для серологической диагностики лихорадки денге. К сожалению, это не так в других регионах мира, особенно в других заморских регионах. Их присутствие не позволяет утверждать постоянную инфекцию, но недавняя инфекция составляет менее трех месяцев. В результате рекомендуется подтвердить диагноз путем анализа выздоравливающей сыворотки.
Чтобы точно установить вид гепатита (вирусный, невирусный, острый, хронический или диффузный), больным следует сдать кровь на антитела. Но такая процедура в обязательном порядке требует предварительной качественнойподготовки.
Поэтому прежде чем делать анализ, следует учитывать такие пункты:
- Сдачу крови надо проводить натощак, так как на протяжении дня ее характеристики значительно отличаются.
- Последнее употребление пищи должно быть минимум за восемь часов до анализа. Не позволяется пить кофе, сок, чай и другие подобные напитки, разрешается только питьевая вода.
- В течение двух дней перед исследованием нельзя есть жирные и жареные продукты, пить алкоголь.
- Несколько часов перед процедурой запрещается курить.
- не сдается после рентгена, ультразвука, массажа, физиотерапии.
- За сутки до процедуры полностью прекращается употребление лекарств, снижаются физические и эмоциональные нагрузки.
- Если невозможно отменить лекарственные препараты, перечень этих средств должен быть указан отдельно еще до проведения анализа.
Столкнувшись с трудностью получения двух последовательных сывороток, лаборатории полагаются на одно положительное обнаружение, чтобы подозревать острую инфекцию. Эта информация полезна для клинических и физиопатологических исследований. Модифицированная Элиза была разработана для обнаружения других классов иммуноглобулинов. Этот сборник, который легче у детей или в неблагополучных условиях, может быть интересен для изучения серопозитивности. Наконец, метод Элиза был адаптирован для определения серотипа, ответственного за инфекцию.
Периоды, когда необходимо сдавать кровь на подтверждение вида гепатита, разнятся. Так, выявить маркеры вируса группы А можно еще при первых симптомах патологии, так как максимально количественная концентрация антител к нему наблюдается на протяжении тридцати дней.
Вирус гепатита С определяется не раньше, нежели через полтора месяца после предполагаемого заражения.
Прямые диагностические методы
Однако этот метод менее надежный в случае вторичной лихорадки денге.
Обнаружение вирусных антигенов
Использование моноклональных антител позволило улучшить специфичность за счет уменьшения поперечных реакций между различными флавивирусами. Было проведено несколько исследований для оценки их чувствительности и специфичности в соответствии с различными критериями анализа: сравнение с традиционными методами диагностики, серотипом, ответственным за инфекцию, временем между наступлением клинических признаков и образец, иммунный статус пациента или тяжесть заболевания.Кровь на вирус можно сдать как в больнице, так и вызвать врача на дом. В любом случае, в процессе процедуры медик должен придерживаться необходимых стерильных мер, то есть использовать одноразовые материалы и инструменты.
Последовательность сдачи крови на анализ:
- Рука в районе предплечья перевязывается медицинским жгутом. Из-за этого движение крови в сосуде приостанавливается, участок вены в районе локтя становится выпуклым. В это место медик и будет вводить иглу.
- Район локтевого сгиба, наполненный кровью, хорошо дезинфицируется, смоченной в спирте ваткой.
- К шприцу подсоединяется игла и вводится в вену. Сразу после этого жгут снимается.
- После того как отобрано необходимое количество жидкости, иглу убирают из сосуда, а к ранке прикладывают ватку, смоченную в спирте. Чтобы быстро остановить кровь и не допустить образования гематомы, его сильно прижимают, затем руку сгибают и прислоняют к туловищу.
Действительно, согласно многоцентровому исследованию Гузмана и др. Комплекты «Пан-Е» и «Платилия» соответственно имеют чувствительность 52 и 66%. Поэтому для определения точного места этого метода для биологической диагностики лихорадки денге необходимы стандартизация и будущие оценки. Из-за его скорости и простоты реализации он может быть использован для экстренного скрининга «у пациентов с постели», госпитализированных для подозрения на серьезную лихорадку денге. Исследование Ванга и Секарана показало, что набор, который также может быть использован для цельной крови, имеет чувствительность 88, 6% и специфичность 98, 7% от сыворотки.
Нормальные показатели и расшифровка
Для определения вируса гепатита А применяется имуннохемилюминисцентный способ установления маркеров lg G вируса. Норма - показатель меньше 1 S/CO. Если результаты выше, это может говорить о присутствии вируса либо ранее перенесенном заболевании.
Маркер гепатита В определяется наличием антител Lg M. Любое их количественное значение является основанием для подтверждения диагноза гепатита В.
Это также может иметь большое значение для диагностики в неэндемичных областях для лихорадки денге. Положительный результат позволяет сделать более ранний диагноз, чем с серологией и лучшим медицинским управлением. Однако отрицательный результат должен привести к продолжению диагноза с помощью методов молекулярной биологии, поскольку риск «ложного отрицания» не является незначительным.
Существует четыре метода: внутримозговая инокуляция новорожденных мышей, культура на клеточных линиях млекопитающих, внутриматочная инокуляция комаров и клеточная культура москитов, причем последние две являются наиболее чувствительными. Эти клетки инокулируют сывороткой, плазмой, биологическими жидкостями или тканевыми экстрактами. Вирусная культура может быть затронута слишком низкой виремией, в зависимости от задержки между сбором и началом клинических признаков: в идеале это время должно быть меньше пяти дней и как можно раньше.
Вирус гепатита С диагностируется методом ИФА. В норме анти HCV-антитела должны отсутствовать. В случае их обнаружения, необходима повторная сдача анализа. Если и дополнительные исследования дали позитивный результат, вирус гепатита С подтверждается.
Маркеры гепатитов D-G тоже устанавливаются посредством иммуноферментного анализа. В случае присутствия антител к вирусам и их рекомбинантам, диагноз подтверждается после двух положительных проб.
Как и все вирусы, этап извлечения доступен сегодня как коммерческие и автоматизированные комплекты. Техника была адаптирована в один этап и в одной трубе, что делает ее более быстрой с меньшим риском загрязнения и при сохранении эквивалентной или даже улучшенной чувствительности. Он также предназначен для использования из цельной крови или клеток периферической крови.
Первоначально в этих протоколах использовалось несколько этапов и тип пары праймеров типа трубки, четыре трубки для одного образца. Затем манипуляции были упрощены, чтобы иметь только один шаг и одну пробирку на образец. Это предназначено для одновременного обработки многих образцов и значительного снижения риска перекрестного загрязнения, не ограничивая при этом чувствительность методов. Большинство исследований непосредственно использовали конкретные праймеры или зонды, специфичные для четырех серотипов.
Определение токсических, аутоиммунных, лучевых, то есть невирусных гепатитов несколько отличается.
В таких случаях используются косвенные методы подтверждения диагноза:
- Анализ на фибриноген. Норма этого белка находится в пределах 1,8 - 3,5 г/л. Пониженное число говорит о гепатите и повреждении тканей печени.
- Анализы на АСТ и АЛТ. Норма для АСТ от 0 до 75 Ед/л, для АЛТ от о до 50-ти Ед/л. Количественное повышение показателей указывает на наличие заболевания.
- Анализ на билирубин. Норма в пределах 5- 21 мкмоль/л. Большее число говорит о развитии патологии.
- Общий белок сыворотки. Норма взрослых 66 - 83 г/л., если числовое значение ниже - это свидетельствует об уменьшении альбумина, то есть о наличии заболевания.
Для подтверждения аутоиммунного гепатита проводятся микроскопические изучения биоптата печени. Такой анализ позволяет выявить количественные специфические поражения органа. Для этого при помощи специальной иглы берется фрагмент ткани печени. Затем материал подвергается обработке особыми реагентами и изучению под микроскопом. Также аутоиммунный гепатит подтверждается, если расшифровка анализа говорит, что уровень гамма глобулина G выше в 1,5 раза и когда антигладкомышечные, антиядерные, антимитохондриальные антитела в высоком титре имеют соотношение более чем 1:80.
Затем манипуляции являются симплексными, дуплексными или квадриплексными. Другие предпочли использовать консенсусные праймеры. Они, несомненно, зависят от способа отбора тестируемых образцов. Многие работы используют серологию, чтобы сделать этот выбор. В результате исследования, которые дают самую низкую чувствительность, - это те, которые полагаются на серологию для отбора проб. Только одно исследование, прошедшее тестирование более 70 пациентов и более дюжины образцов на серотип, показывает чувствительность более 85% для всех серотипов.
Помимо этого, при таком диагнозе у больного присутствуют признаки воспаления тканей печении и ее недостаточность.
Все тонкости расшифровки анализа может знать только опытный специалист, так как, например, отдельное количественное увеличение общего белка необязательно является подтверждением болезни печени, а понижение альбумина может говорить о патологии почек.
В целом, результаты чувствительности, о которых сообщается в различных публикациях, являются разрозненными, а количество тестируемых образцов является низким с часто дисбалансом между четырьмя серотипами. Определяющим параметром является время между наступлением клинических признаков и выборкой. Виремия имеет тенденцию быть более высокой и более долговечной во время первичных инфекций.
Максимальный балл получил только две лаборатории. Результаты подчеркнули, что молекулярная диагностика лихорадки денге нуждается в улучшении для 28 лабораторий. Только пять методов соответствовали всем критериям чувствительности и специфичности, а четыре других достигли приемлемого результата. Результаты, полученные с этим, варьируются от одной лаборатории к другой.
Дополнительные анализы
Одно только исследование крови не всегда позволяет правильно установить диагноз и выяснить точную причину болезни. В некоторых вариантах делается бромсульфалеиновая проба. Это исследование позволяет проанализировать работу печени.
Бромсульфалеин вводится в кровь, из нее попадает в печень, затем в желчь и выводится естественным путем. Помимо этого, при подозрении на патологию может быть назначено ультразвуковое обследование печени. Это позволит определить размер органа (увеличен или нет), неоднородность его тканей (наличие фиброза, гипертрофии и др.), неточность контуров. Подобные изменения как раз и характерны для гепатитов.
Сегодня на рынке доступно несколько наборов, и их результаты остаются неутешительными. Недавно были опубликованы рекомендации по оценке диагностических тестов лихорадки денге. Лихорадка денге в Мартинике является эндемической эпидемией с сезонными подъемами и во время эпидемий массовый приток пациентов в чрезвычайных ситуациях. Мы используем диагностический алгоритм с учетом даты начала лихорадки.
Серологические тесты полезны только для диагностики поздней стадии инфекции. Поэтому методы молекулярной биологии являются инструментом выбора для диагностики лихорадки денге во время острой фазы. Однако их чувствительность и специфичность еще не оптимальны, и их необходимо стандартизировать. Достижения в развитии четырехвалентной вакцины предполагают лучший контроль над лихорадкой лихорадки денге и результаты широкомасштабных испытаний эффективности в настоящее время в ожидании.
В нынешнее время, чтобы определить вирус, часто применяется такой метод молекулярной диагностики, как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Его преимущество в высокой чувствительности, а значит, большой точности.
Этот анализ основан на неоднократном копировании определенной части ДНК или РНК посредством ферментного воздействия. В результате образуются задвоенные отрезки генетической цепочки, благодаря которым можно выявить даже незначительное количество возбудителя.
ПЦР-исследования позволяют, определить вирус и поставить точный диагноз уже через несколько часов. Этот метод выявляет именно возбудителя, в то время, как другие анализы устанавливают лишь реакцию организма на вирус. Но у этого способа есть и свои недостатки. Все исследования должны проводиться только в стерильных условиях. Даже малейшее загрязнение способно повлиять на результаты.
Помимо этого, делать подобные тесты и расшифровку может только медик с большим опытом работы в сфере генетики.
Учитывая все вышеперечисленные факторы, нельзя сказать, что способ ПРЦ всегда точен. Он может показать неправильный результат как в положительную, так и в отрицательную сторону.
Для качественного лечения вирусных видов гепатита применяются иммуномодуляторы и противовирусные средства. Но так как эти препараты оказывают достаточно сильное воздействие на организм, прежде чем их приписать врач должен быть абсолютно уверен, что причиной патологии является именно вирусная инфекция. Поэтому могут быть назначены дополнительные анализы и исследования.
Страница 2 из 2
Сопоставление результатов молекулярной и ИФА-диагностики ХГС
В связи с недостаточной информативностью клинико-лабораторных тестов, при подозрении на ХГ использующихся на первом этапе обследования пациентов с ревматическими заболеваниями, особую актуальность приобретает вирусологическое исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа и ПЦР.
Как указывают некоторые авторы при доступном иммуноферментном анализе возможны ложноположительные результаты, что чаще всего является следствием наличия в анализируемом образце антител к супероксиддисмутазе, совместно с которой в рекомбинантных дрожжевых клетках синтезируется с100-3, использующийся в качестве анигена в иммуноферментных тест-системах для идентификации ВГС . На результаты тестирования также влияют гипергаммаглобулинемия на фоне системных заболеваний соединительной ткани, недавние вакцинации (особенно к кори), криоглобулинемия, т. к. HCV может образовывать криопреципитат . Сообщалось о ложноположительных результатах после повторного размораживания образцов или после их длительного хранения при нестабильной температуре. Антитела к HCV образуются в среднем за 8 - 20 недель с момента инфицирования или через 15 недель от начала гепатита, у некоторых больных для образования антител требуется около года. Отсутствие антител к HCV не исключает диагноз HCV. Кроме того, 20% больных хроническим HCV могут быть серонегативными, так как содержат низкие титры анти-HCV антител на фоне иммунодефицита или иммуносупрессивной терапии .
ПЦР ткани печени в парафиновых срезах проведена нами в 44 случаях, из них в 23 (52,3%) зафиксирован отрицательный результат, в 20 (45,5%) - положительный, в одном случае (2,3%) зафиксирован отрицательный результат ПЦР в ткани при положительном ПЦР в крови пациента, что нами было интерпретировано как ранний период вирусного гепатита С на фоне РА.
Из 136 исследований ПЦР крови тест был положительным у 74 пациентов (54,4%), отрицательным в 62 (45,6%) случаях. В трех случаях (2,2%) положительный ПЦР-тест крови у больных РА сочетался с отрицательными данными ИФА, что было расценено как ложноотрицательные результаты иммуноферментного анализа. Два (0,6 %) отрицательных ПЦР теста сопровождались положительным заключением по ИФА при реактивном артрите, что позволило интерпретировать результат как ложноположительный, таблица 3.
ИФА на вирус гепатита С проведено в исследованной группе у 332 пациентов. Тест был положительным в 176 случаях (53%) и отрицательным в 139 (41,9%), в 17 случаях результаты теста были сомнительными (5,1 %), таблица 2.
Таблица 2 - Частота получения ложноположительных и ложноотрицательных заключений на вирус гепатита С методом ИФА при различных заболеваниях
Нозология
Ложноположительные
Нозология
Ложноотрицательные
активности
Как видно из таблицы 2 наибольшее число ложноположительных заключений (0,9%) по ИФА-диагностике получено в группе пациентов с СКВ С и РА С, что, на наш взгляд, связано с наличием большого числа циркулирующих иммунных комплексов и несовершенством методики ИФА 1 и 2 поколений для пациентов с аутоиммунной патологией.
Полученные данные свидетельствуют, что при постановке диагноза ХГС на фоне ревматических заболеваний нельзя ориентироваться на результаты одного теста. Все это послужило предпосылкой к сопоставлению результатов различных способов лабораторной диагностики вируса гепатита С.
Нами было отобрано 33 больных, у которых не было однозначной трактовки и направленности в заключениях по наличию вируса гепатита С при ИФА, ПЦР и иммуногистохимической диагностике (таблица 3).
Адаптированной методикой ПЦР в тканях проведено исследование биопсийного в случаях, когда лабораторная и серологическая диагностика ХГС не позволяла достоверно судить о наличии вируса гепатита С и клинический диагноз не мог быть окончательно установлен.
В целом, изменение окончательного диагноза с учетом результатов молекулярной диагностики биоптата осуществлено у 15 больных из 169 пропунктированных пациентов, что составляет 8,9 %.
Таблица 3 - Соотношение спорных результатов тестирования на ВГС
Особенно настораживает гипердиагностика ХГС с использованием ИФА тест-систем, в данном случае мы имеем дело либо с самой ранней стадией ХГС и его внепеченочной пролиферацией, либо с чистой гипердиагностикой данного заболевания. Имеющиеся различия в заключениях обусловлены тем, что ПЦР не требуют осаждения иммунных комплексов, как при ИФА-тестах, следовательно ложноположительных реакций практически нет. Как отмечено некоторыми авторами из 100 больных с РНК HCV антитела класса Ig M к HCV были обнаружены в 66 % случаев, в то же время из 171 сыворотки с отрицательными ПЦР-данными антитела класса Ig M к HCV были обнаружены в 45 случаях, что свидетельствует либо о ложноположительных результатах, либо о колеблющейся виремии, либо о внепеченочной репликации вируса . В нашем исследовании у 4-х больных (2 - СКВ С, 1 - РА С, 1 - ХГС) были положительны тесты исследования на РНК - ВГС в крови, но отрицательные в ткани печени, что также может быть подтверждением внепеченочной репликации вируса, либо ранней фазой течения ХГС.
Чувствительность и специфичность тестов детекции ВГС в крови и тканях, представлены в таблице 4, из которой следует, что методы молекулярной диагностики высокочувствительны и специфичны.
Таблица 4 - Чувствительность и специфичность тестов детекции ВГС в крови и тканях
Чувствительность (%)
Специфичность (%)
ПЦР в крови
ПЦР в ткани
Иммуногистохимия
Учитывая большое число различных аутоантител, методы молекулярной диагностики вирусных гепатитов по анализам крови более оправданы, чем иммуноферментный анализ у лиц с СЗСТ а верификация неструктурных белков ВГС в тканях возможна только с использованием методов молекулярных диагностики (ПЦР в ткани и иммуногистохимии).
Заключение
Очаговая деструкция хрящевой и костной ткани - ведущий механизм повреждения суставов при РА. В поддержании воспалительных изменений, протекающих при ревматических заболеваниях, значительная роль принадлежит нейтрофилам и лимфоцитам. Показано, что наличие неспецифической реактивности нейтрофилов отражает их патогенетическую значимость и избирательную устойчивость к ВГС. Клиническая картина ХГС в целом ряде наблюдений характеризуется не только поражением печеночной ткани, но и различными внепеченочными проявлениями, которые могут быть обусловлены иммунокомплексными механизмами. Более полному пониманию патогенеза системных проявлений при хронической вирусной инфекции будет способствовать установление факта внепеченочной репликации вирусов гепатита, что подтверждено обнаружением антигенов ВГС в лимфоцитах при использовании высокоспецифичных методов ПЦР и иммуногистохимии.
Методами молекулярной диагностики установлена тропность ВГС помимо печеночной к почечной ткани, причем оба органа поражаются одновременно. Неструктурные белки ВГС обнаружены также в ткани легкого (бронхиальном эпителии), лимфоцитах периферической крови и портальных трактов, эпителии билиарных протоков. В клинически неоднозначных ситуациях с высоким уровнем гепатоспецифических ферментов показано морфологическое исследование печеночного биоптата для верификации ВГС в тканях. Иммуногистохимическое исследование биоптата при криптогенном гепатите позволиляет диагностировать вирусное поражение печени, в том числе ХГС, протекающего без наличия РНК - ВГС в крови. С другой стороны ПБП позволяет исключить диагноз ХГС. В группе больных СЗСТ метод ИФА приемлем в основном для скрининга обследуемых на наличие ВГС и предпочтение следует отдавать методам молекулярной диагностики.
Литература
1. Ивашкин, В. Т. Болезни суставов. Пропедевтика, дифференциальный диагноз, лечение / В. Т. Ивашкин, В. К. Султанов. М.: Литтерра, 2005. 544 с.
2. Serum HCV RNA levels correlate with histological liver damage and concur with steatosis in progression of chronic hepatitis C / L. Adinolfi // Dig. Dis. Sci. 2001. Vol. 46. № 8. P. 1677-1683.
3. Disappearance of serum HCV-RNA after short-term prednisolone therapy in a patient with chronic hepatitis C associated with autoimmune hepatitis-like serological manifestations / M. Yoshikawa // J. Gastroenterol. 1999. Vol. 34. № 2. P. 269-274.
4. False-positive anti-HCV tests in rheumatoid arthritis / L. Theilmann // Lancet. 1990. Vol. 335. № 8701. P. 1346.
5. Amarapurkar, D. Role of autoimmunity in nonviral chronic liver disease / D. Amarapurkar, A. Amarapurkar // J. Assoc. Physicians India. 2000. Vol. 48. № 11. P. 1064-1069.
6. Boyer, N. Patogenesis, diagnosis and management of hepatitis C / N. Boyer, P.Marcellin // J. Hepatol. 2000. Vol. 32. №.2. suppl. P. 98-112.
7. Andreas, C. Chisari Pathogenesis of Chronic Hepatitis C: Immunological Features of Hepatic Injury and Viral Persistence / C. Andreas, V. Francis // Hepatology. 1999. Vol. 30. № 3. P. 595-601.
