Специфическая лабораторная диагностика вирусных гепатитов основывается на применении иммунохимических и молекулярно-биологических методов исследований. Основными иммунохимическими методами являются радиоизотопный или радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный (ИФА). В основе иммунохимических методов диагностики лежит специфическое взаимодействие антиген - антитело с последующим выявлением комплекса при помощи специальных меток. Наиболее распространенным является иммуноферментный анализ.
Вирус гепатита В является прототипом гепаднавируса; 40% людей имеют текущую или прошлую инфекцию. В ходе глобального исследования вирусного разнообразия в летучих мышах мы обнаружили три уникальных вида гепаднавируса. После воскрешения из тканей летучей мыши, псевдотипированные вирусы, несущие поверхностные белки одного игорного вируса, могут заразить клетки печени человека.
Подготовка к иммуноферментному анализу
Инфицированные печени показали гистопатологические изменения, совместимые с гепатитом. До 4% сыворотки летучей мыши содержали антитела против летучих гепанавирусов. Инфекционные клоны были созданы для детального изучения всех трех вирусов. Антихеднадзорная терапия с использованием одобренного ингибитора обратной транскриптазы блокировала репликацию всех летучих гепанавирусов.
Первые сообщения о применении иммуноферментного анализа , как метода для определения каких-либо веществ были опубликованы в 1971 году одновременно двумя исследовательскими группами - В. Van Weemen, A. Schuurs и Е. Engvall, P. Perlmann. В основе иммуноферментного анализа лежит следующий принцип: на твердой фазе, в качестве которой используется, главным образом, поверхность лунок полистиролового планшета, фиксируется антиген возбудителя инфекции или антитела (часто смесь антител) к антигенам, которые необходимо обнаружить. Этот антиген или антитела, которые зафиксированы на твердой фазе, называются иммуносорбентом.
Наши данные свидетельствуют о том, что летучие мыши могут быть предковыми источниками гепаднавирусов приматов. Эволюция зооноз виром метагеномика обратная генетика. . Потенциал для уничтожения вируса подтверждается тем фактом, что нет известных резервуаров для животных.
Эти хозяева грызунов являются эндемичными в ограниченных районах Северной Америки, и их вирусы имеют высокую специфичность для хозяина и не могут инфицировать человеческие гепатоциты. Ранее мы проанализировали роль летучих мышей в эволюции патогенных вирусов с использованием очень больших глобальных и филогенетически полных образцов животных. Эти экземпляры представляли 54 разных вида и 11 из 18 существующих семей летучих мышей. Положительные образцы происходили от трех разных видов летучих мышей.
В результате инкубации иммуносорбента и испытуемой сыворотки при наличии определяемого агента происходит их связывание в комплекс антиген - антитело. После процедуры промывки, в ходе которой удаляются несвязанные антигены и антитела, проводится инкубация с конъюгатом. В качестве конъюгата при детекции HBsAg используют анти-HBs, при детекции антител к вирусу гепатита С -антитела к иммуноглобулинам человека (антивидовой конъюгат), меченные пероксидазой хрена. В итоге этой инкубации происходит присоединение к уже имеющимся комплексам антиген - антитело дополнительно внесенного конъюгата. После удаления несвязавшегося конъюгата (отмывки) в лунки вносится субстрат. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата используют перекись водорода в сочетании с индикатором, в качестве которого наиболее часто применяют ортофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ). Результат оценивается фотометрически.
Рядом с сайтами дается количество выборочных видов и образцов на семью. Красный, положительный вид летучих мышей; серый, распределение положительных летучих мышей. Витамины летучей мыши образовали три разных рода на предварительном филогенетическом осмотре. Вирусные обозначения были выбраны в соответствии с обозначением других нечеловеческих гепаднавирусов на основе общих названий их хозяев, и они подробно описаны на рисунке. Все вирусы летучей мыши различаются по своим нуклеотидным последовательностям по меньшей мере на 35% из последовательностей любого известного гепаднавируса.
Качество и надежность аналитических возможностей иммуноферментного метода характеризуются рядом критериев, к числу которых относятся чувствительность, специфичность, правильность и воспроизводимость.
Чувствительность - то минимальное количество вещества, которое может быть обнаружено при помощи иммуноферментного анализа. При этом нижним пределом чувствительности данного метода является концентрация исследуемого вещества в образце, которая соответствует наименьшему положительному результату определения, статистически достоверно отличающемуся от показателей заведомо отрицательных образцов. Чувствительность ИФТС зависит от ряда обстоятельств, связанных как с конструкцией тест-системы (аффинность иммуносорбента, качества экстракционных и буферных систем), так и разрешающей способностью и точностью метода регистрации.
Приматы и новые вирусы летучей мыши вместе находились в отношениях сестры со всеми вирусами летучей мыши в старом мире. Филогенетический анализ, включающий в себя уникальные вирусы летучих мышей. Уникальные вирусы летучей мыши из этого исследования красны. Концентрации в тканях печени хиппозидерных летучих мышей были значительно выше, чем концентрации в других органах или сыворотке. Для летучих мышей Нового мира не было образцов органов. Серореактивность в летучих мышах Нового Света не оценивалась, поскольку вторичные антитела к этим видам недоступны.
Специфичность - способность выявлять именно те компоненты, для определения которых предназначена данная иммуноферментная тест-система. Специфичность определяется во многом перекрестной реакцией антител или антигенов (то есть композиции, используемой в качестве иммуносорбента), с близкородственными соединениями, а также составом инкубационной среды (матрикс-эффект).
Частота обнаружения антител была высокой, у 4% - у хиппосадидовых летучих мышей и 3% у носорогных битов. Антитело-положительная сыворотка от ринолофидной летучей мыши перекрестно распознавала антивирусные вирусы хиппосеридной летучей мыши, а шесть из девяти антител-положительных хиппосеридных летучих сывороток перекрестно распознавали антивирусные вирусы вируса ринолофида. Эти три сыворотки, которые не проявляли перекрестной реактивности, имели более низкие титры, чем другие сыворотки.
Репликативная способность в клетках человека
Потенциал для заражения человеческих клеток
Степень перинатальной передачи может повлиять на степень хронической вирусной перевозки, которая является главной характеристикой всех гепаднавирусов. Мы не могли определить здесь, в какой степени хронические инфекции возникают у летучих мышей. Существует полное отсутствие обнаружения у обезьян-циркопитекоидов, а также более низких неодинаковых обезьян.Правильность - соответствие среднего значения результатов повторных определений одного и того же контрольного образца с истинной величиной измеряемого параметра. Правильность определения в ИФА зависит от качества самой тест-системы и контрольного образца. Для хороших иммуноферментных тест-систем показатели правильности лежат в пределах 90-110 %. Особенностью медико-биологических исследований в ИФА является невозможность установления точной величины, и поэтому за истинную величину принимается средняя от нескольких экспертных лабораторий. Статистическим критерием правильности служит средняя арифметическая и степень ее отклонения от истинного значения, выраженная в процентах.
Следует отметить, что это животное могло быть летучей мышью, но стебельная линия, ведущая к вирусам приматов, также могла быть приобретена из любого другого источника. Поэтому мы провели углубленные исследования зоонозного потенциала описанных летучих гепанавирусов с использованием нескольких хорошо известных методов. Однако мы наблюдали заметные различия между культурами первичных людей и тупайской гепатоцитов.
Следует отметить, что есть несколько ограничений в наших усилиях по оценке зоонозного потенциала. Однако дополнительное доказательство зоонозного потенциала потребует прививки шимпанзе, что не является этическим с учетом ожидаемой тяжести инфекции. Флоран Вирон, Лауре Патурл, Раймонд Сезар.
Воспроизводимость - способность тест-системы показывать одни и те же значения при повторных исследованиях одного и того же образца. Воспроизводимость зависит как от случайных погрешностей (ошибок) при проведении процедуры постановки реакции, так и от качества тест-систем и точности метода регистрации результатов. Считается, что воспроизводимость одних и тех же контрольных образцов одной фирмы в разных лабораториях не должна превышать величину коэффициента вариации в 15%.
Нормальные показатели и расшифровка
Это обернутый вирус диаметром 50 нм. Существуют четыре различных серотипа. Межсеротипическая белковая гомология составляет от 60 до 80%. Каждый серотип включает несколько подтипов или генотипов. Термин «вторичная лихорадка денге» используется для любого последующего заражения того же организма другим серотипом. Этот термин относится к разным семействам вирусов, передаваемых между хозяевами позвоночных через векторы: гематофагические членистоногие. Этот москит имеет суточную активность и живет в антропогенных домиках в городских районах.
Существует несколько специфических схем ИФА для определения маркеров вирусных гепатитов: а) прямой иммуноферментный анализ; б) непрямой иммуноферментный анализ; в) конкурентное ингибирование; в) «ловушеч-ный», или «capture» метод.
Из молекулярно-биологических методов диагностики вирусных гепатитов чаще используются полимеразная цепная реакция и гибридизация. Эти методы, особенно ПЦР, позволяют выявлять очень малые количества специфической вирусной ДНК или РНК и, таким образом, судить о репликации, а в ряде случаев и об активности репликации.
До сих пор векторный контроль остается основным средством профилактики и контроля лихорадки денге. Лихорадка денге является наиболее распространенным типом арбовироза человека. Описанный в конце восемнадцатого века, он уже давно считается доброкачественной тропической болезнью. Лихорадка денге классифицируется как возникающая болезнь из-за ее повышенной распространенности, заболеваемости и географического распределения за последние 20 лет. Положение в тропической Африке парадоксально, вирус и его вектор присутствуют, но зарегистрированных эпидемий мало.
Гепатит С - это название заболевания, поражающего крайне важнейший орган - печень. Вирус гепатита С относится к РНК-содержащим патогенам. Впервые данный микроорганизм был выявлен в конце 80-х годов двадцатого столетия.
Пути распространения заболевания можно разделить по группам:
Анализ на гепатит должны сдавать люди, которые:
Недавний обзор свидетельствует о недооценке случаев, связанных с распространенностью других фебрильных синдромов, таких как малярия, и отсутствием диагностических и надзорных учреждений. Другие предположения включают перекрестную защиту с другими эндемическими флавивирусными инфекциями и снижение векторной компетентности. Мероприятия по надзору, расследованию, предупреждению и борьбе с эпидемиями осуществлялись на местном уровне. Лихорадка лихорадки денге в настоящее время затрагивает, помимо интертропического пояса, регионы с более умеренным климатом, такие как юг Соединенных Штатов и Европы или Австралии.
ВГС анализ крови является лабораторным методом диагностики гепатита С, механизм его действия построен на идентификации антител типа Ig G и Ig M, которые начинают активно вырабатываться при появлении в крови антител вируса. Что это такое? Это патогенные микроорганизмы, появляющиеся спустя несколько недель или даже месяцев с момента инфицирования человека.
В общей клинической форме, известной как «классическая лихорадка денге», симптомы обычно ассоциируют высокую температуру внезапного начала с артралгией и миалгией. Незначительные геморрагические проявления, такие как петехии, гингиворагия и эпистаксис, не являются редкостью. Эволюция наиболее часто благоприятна, с возвращением к апирексии менее чем за неделю. Иногда вирусная инфекция является серьезной с угрожающим жизни синдромом течения плазмы; это называется «геморрагическая лихорадка денге с синдромом шока или без него».
Согласно теории «иммунного облегчения инфекции», люди, впервые заразившиеся вирусом, приобрели антитела, постоянно нейтрализующие вирусы заражающего серотипа, но не нейтрализующие или присутствующие в нейтрализующих концентрации для других. серотипов. Таким образом, они будут предрасполагать к более тяжелой болезни во время вторичной инфекции.
Расшифровка анализа
Изучая строение ВГС, ученые пришли к выводу, что данный возбудитель представляет собой геном, относящийся, как к животным, так и к растительным вирусам. Он состоит из одного гена, в который умещается информация о девяти белках. На первые возложена задача по проникновению вируса внутрь клетки, вторые отвечают за формирование вирусной частицы, а третьи в это время переключают естественные функции клетки на себя. Они относятся к структурной группе белков, когда остальные шесть - это неструктурные.
Растет интерес к роли врожденного ответа и дендритных клеток. Они различают три фазы, острое фебрильное, критическое и выздоравливающее. Любое повторение лихорадки после седьмого дня должно предполагать бактериальную инфекцию или другие осложнения. В отсутствие специфического противовирусного лечения задача для клиницистов заключается в выявлении ранних пациентов, которые могут вырабатывать тяжелые формы и проводить симптоматические меры, если таковые имеются, в условиях стационара, уделяя особое внимание гидроэлектролитический баланс.
Геном ВГС - это одна РНК нить, заключенная в собственную капсулу (капсид), образованную нуклеокапсидным белком. Все это обволакивается оболочкой, состоящей из белков и липидов, она позволяет успешно связываться вирусу со здоровой клеткой.
Как только вирус попадает в кровь, он начинает циркулировать по всему организму через кровеносный поток. Попав в печень, геном активизирует свои функции и присоединяется к клеткам печени, постепенно проникая внутрь них. Гепатоциты (так называются эти клетки) претерпевают нарушений в ходе своего функционирования. Их основной задачей становится «работа на вирус», в процессе которой им необходимо синтезировать вирусные белки и рибонуклеиновую кислоту.
Ранняя, быстрая и надежная биологическая диагностика необходима для лечения подозрительных клинических случаев тяжелой лихорадки денге. Вирусологический диагноз также необходим для эпидемиологического надзора. В ожидании будущих антивирусных терапевтических испытаний методы диагностики денге используются в испытаниях вакцин. Мы опишем основные методы биологической диагностики лихорадки денге, подчеркнув их значимость или не в клиническом контексте.
Кинетика биологических маркеров
Параллельно с эпидемиологическим контекстом и клиническим представлением несколько биологических параметров усиливают подозрение на лихорадку денге. Наиболее примечательной является прогрессирующая тромбоцитопения, максимальная между четвертым и седьмым днями заболевания, иногда очень тяжелая. Ранняя лимфопения, присутствующая с начала лихорадки, сохраняется в течение трех-пяти дней, тогда как прогрессирующая вторичная нейтропения достигает пика между четвертым и шестым днями заболевания. Эти тенденции наблюдаются у всех пациентов в разной степени.
Чем дольше ВГС находится в печени, тем больше клеток органа поражается и гибнет, что грозит их перерождением в злокачественную опухоль.
ВГС различает в себе несколько генотипов, то есть штаммов. На данный момент известно 6 генотипов, при этом каждый этот вид имеет свои подвиды. Все они 
обозначаются в зависимости от нумерации от 1 до 6. Есть сведенья о локализации того или оного вируса в пределах земного шара. К примеру, 1, 2 и 3 генотип встречается в пределах всего мира, в то время как 4 - в большей степени на Среднем Востоке и Африке, 5 - в Южной Африке, а 6 - на Юго-Восточной Азии.
Кинетика вирусологических маркеров
Признано, что тяжесть лейкопении и особенно тромбоцитопении отражает потенциальную тяжесть заболевания. У людей после инокуляции вируса через укус комара существует инкубационный период от трех до семи дней. Затем вирус распространяется по всему телу и обнаруживается в крови, мононуклеарных клетках и некоторых тканях. Появление клинических признаков, включая лихорадку, совпадает с этим распространением: виремия начинается за два дня до появления клинических признаков и продолжается в течение четырех-восьми дней.
Основанием для назначения лечения должен быть положительный результат анализа крови на ВГС, а также определенный генотип.
Расшифровка ВГС анализа:
- Анти-ВГС Ig M - маркер активной репликации вируса гепатита С;
- Анти-ВГС Ig G - вероятное присутствие вируса гепатита С;
- Ag ВГС - положительный результат, свидетельствующий о наличии вируса гепатита С;
- РНК ВГС - вирус гепатита С присутствует в организме и активно прогрессирует.
Ложноположительный результат
На медицинской практике хоть и редко, но встречались случаи ложноположительного результата ВГС анализа. Такое возможно в ситуации с беременными и с людьми, у которых имеются какие-то другие инфекционные заболевания.
Затем иммунный ответ хозяина отличается тем, что он находится в присутствии первичной лихорадки денге или вторичной лихорадки денге. Диагностические методы должны учитывать задержку между сбором и появлением клинических признаков. На ранней стадии заболевания предпочтительны прямые диагностические методы для вирусной инфекции. Если выборка произойдет позже, могут использоваться косвенные методы диагностики. В соответствии с рекомендацией Экспертной комиссии Высшего совета общественного здравоохранения может быть полезно использовать прямые и косвенные методы диагностики в решающий период.
С еще меньшей вероятностью можно говорить о ложноотрицательных результатах, которые регистрируются у пациентов, принимающих иммунодепрессанты, либо на это повлияли особенности их иммунной системы. Тот же результат ожидается, если гепатит С находится на начальной стадии развития.
При возникновении недоразумений Вы можете прибегнуть к ПЦР тесту гепатита С, если он даст положительный результат, то сдайте еще анализ для определения вирусного генотипа.
Косвенные методы диагностики
Однако сегодня существуют альтернативные методы. Использование капиллярной крови, прикрепленной к блоттинговой бумаге, является проверенной методикой, которая позволяет легко транспортировать образцы. С другой стороны, эта чувствительность составляет 100% в случае вторичной лихорадки денге. Первоначально ингибирование гемагглютинации, фиксацию комплемента и методы серонутрализации использовали для обнаружения антител против лихорадки денге. Сегодня эти методы были вытеснены методами Элиса благодаря маркетингу нескольких наборов.
Срок действия и как сдавать
Анализ на гепатит С подразумевает под собой забор крови у пациента натощак, учитывая, что поужинать он должен не позднее, чем за 8 часов до сдачи материала. После пробуждения можно выпить лишь немного простой негазированной воды. Будет лучше, если накануне исследования Вы проследите за своим питанием, сделав его максимально легким и простым. Жареные и жирные продукты полностью должны быть исключены, так же как и алкоголь. Тяжелый физический труд и спорт может повлиять на достоверность результатов теста, поэтому постарайтесь избежать этого.
Если Вы собираетесь сдавать кровь на анализ для выявления гепатита С, то Вам должны сказать о том, что лекарственные препараты могут исказить реальные значения, поэтому проводите исследование либо до начала приема лекарств, либо уже спустя пару недель после их отмены. Если остановить медикаментозное лечение невозможно по показаниям врача, то предупредите об этом медсестру, принимающую анализ. Она должна отметить у себя название принимаемого лекарственного средства и дозировку, в которой Вам его прописали.
Для лабораторного исследования требуется сыворотка крови. Сколько действительны материалы? Они могут храниться менее пяти дней при температурном режиме от 2-х до 8-ми градусов по Цельсию, и более пяти дней при условии, что температура хранения будет -20 градусов по Цельсию.
ВГС анализ крови делается в обязательном порядке для людей с иммунодефицитными состояниями, в особенности с ВИЧ.
