За последние 20 лет накоплены сведения о плейотропных, неэритропоэтических функциях эритропоэтина (ЭПО), система ЭПО - рецептор ЭПО на ауто- и паракринном уровнях рассматривается как звено неспецифической защиты при повреждении, а рецепторы ЭПО на неэритроидных клетках, в частности на различных популяциях лейкоцитов, в том числе фагоцитах, обозначаются как защищающие ткань рецепторы. Цель работы – исследовать влияние различных концентраций ЭПО на функциональную активность фагоцитов в экспериментальных условиях in vitro – реализована на цельной крови 20 клинически здоровых людей. Рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Эпокрин» (международное непатентованное название: эпоэтин альфа, ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА России, г. Санкт-Петербург) применяли в концентрациях 1,88 МЕ/л; 3,75 МЕ/л; 7,5 МЕ/л; 15 МЕ/л; 30 МЕ/л, что соответствует от 12,5, 25, 50, 100, 200% от среднего физиологического уровня ЭПО в крови, показатели исследовали после 10 и 30 мин инкубации в термостате при 37 °С. Функцию фагоцитов исследовали по способности поглощать частицы монодисперсного, полистирольного латекса и кислород-зависимому внутриклеточному метаболизму в спонтанном и индуцированном тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тесте). Установлено, что 10-минутный контакт ЭПО с цельной кровью не оказывает статистически значимого влияния на функцию фагоцитов, после 30-минутной инкубации ЭПО с цельной кровью зафиксирована активация поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма фагоцитов периферической крови. Выявлено, что ЭПО в диапазоне доз от 1,88 до 30 МЕ/л увеличивает количество активно фагоцитирующих клеток и поглотительную способность отдельного фагоцита; в дозах 3,75 и 15 МЕ/л ЭПО повышает количество клеток, генерирующих активные метаболиты кислорода, и интенсивность генерации активных метаболитов кислорода отдельным фагоцитом в индуцированном НСТ-тесте. Эффект ЭПО на функциональную активность фагоцитов не зависит от дозы.
фагоцитоз
врожденный иммунитет
эритропоэтин
1. Осиков М.В. Анализ эфферентных свойств церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном перитоните / М.В. Осиков, Л.В. Кривохижина, А.В. Мальцев // Эфферентная терапия. – 2006. – Т. 12, № 4. – С. 36-39.
2. Осиков М.В. Влияние гемодиализа на процессы свободнорадикального окисления у больных хронической почечной недостаточностью / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2007. – № 16 (71). – С. 95-97.
3. Осиков М.В. Гемостазиологические эффекты альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном септическом перитоните / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С. 143-145.
4. Осиков М.В. Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на процессы свободнорадикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29-31.
5. Осиков М.В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 9-3. – С. 462-466.
6. Осиков М.В. Эфферентные и антиоксидантные свойства эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Ю.И. Агеев // Эфферентная терапия. – 2011. – Т. 17, № 4. – С. 7-13.
7. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6. - URL: www..02.2014).
8. Осиков М.В. Современные представления о гемостазиологических эффектах эритропоэтина / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5-1. – С. 196-200.
9. Осиков М.В. Эритропоэтин как регулятор экспрессии тромбоцитарных гликопротеинов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1. - URL: www..02.2014).
10. Broxmeyer H.E. Erythropoietin: multiple targets, actions, and modifying influences for biological and clinical consideration // J. Exp. Med. – 2013. – Vol. 210 (2). – P. 205-208.
Клеточные механизмы врожденного иммунитета связаны с реализацией функциональной активности фагоцитирующих клеток, прежде всего нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Изменение функции фагоцитов может являться ключевым звеном патогенеза при различных заболеваниях и типовых изменениях гомеостаза . Так, при хронической почечной недостаточности активация врожденного звена иммунитета и связанная с ней манифестация локального и системного воспаления способствует развитию и прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний; при термической травме изменения функции фагоцитов сопряжены с динамикой и успешным завершением репаративных процессов. Одной из ключевых задач современной медицинской науки является поиск регуляторов функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета. Ранее нами продемонстрирована роль биологически активных веществ эндогенной природы церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротеина в регуляции функции фагоцитов при различной патологии . В последние годы внимание многих исследователей привлекают плейотропные эффекты эритропоэтина (ЭПО). Впервые ЭПО стал известен как гемопоэтин - фактор, стимулирующий образование эритроцитов de novo, благодаря пионерской работе Carnot and Deflandre, опубликованной в 1906 г. Основным местом синтеза ЭПО являются перитубулярные и тубулярные клетки почек, в которых в ответ на снижение парциального давления кислорода экспрессируется ген ЭПО при участии гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF-1). Современные представления о механизмах действия ЭПО на молекулярном уровне позволяют отнести его одновременно к гормонам, факторам роста и цитокинам. Основной точкой приложения для действия ЭПО являются клетки эритроидного ряда в костном мозге: бурст- и колониеобразующие единицы гранулоцитарно-моноцитарно-мегакариоцитарно-эритроцитарные, эритроцитарные, а также эритробласты и пронормобласты, на которых имеются специфические рецепторы. ЭПО отвечает за пролиферацию, дифференцировку и угнетение апоптоза в этих клетках. Открытие рецепторов для ЭПО на клетках неэритроидных тканей, таких как нейроны, кардиомиоциты, клетки почек, эндотелиоциты позволило обнаружить новые биологические эффекты ЭПО. Ранее нами показана протективная роль ЭПО при хронической почечной недостаточности в клинических и экспериментальных условиях в отношении аффективного статуса, психофизиологического статуса, функционального состояния системы гемостаза и др. . Полагаем, что косвенная реализация плейотропных эффектов ЭПО может быть связана с его влиянием на функцию фагоцитирующих клеток. В настоящее время система ЭПО-рецептор ЭПО на ауто- и паракринном уровне рассматривается как звено неспецифической защиты при повреждении, а рецепторы ЭПО на неэритроидных клетках обозначаются как защищающие ткань рецепторы. Цель работы - исследовать влияние различных концентраций ЭПО на функциональную активность фагоцитов в экспериментальных условиях in vitro.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена с использованием цельной крови 20 клинически здоровых людей-доноров. Рекомбинантный человеческий эритропоэтин в составе препарата «Эпокрин» (международное непатентованное название: эпоэтин альфа, ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА России, г. Санкт-Петербург) применяли в концентрациях 1,88; 3,75; 7,5; 15; 30 МЕ/л, что соответствует от 12,5, 25, 50, 100, 200% от среднего физиологического уровня ЭПО в крови, показатели исследовали после 10 мин и 30 мин инкубации в термостате при 37 °С. Функцию фагоцитов исследовали по фагоцитарной способности и кислородзависимому внутриклеточному метаболизму. Фагоцитарную способность лейкоцитов оценивали по поглощению частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм), полистирольного латекса, для чего 200 мкл суспензии клеток смешивали с 20 мкл взвеси частиц полистирольного латекса. После 30 мин инкубации при температуре 37 °С оценивали активность и интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число. Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма в фагоцитах проводили с помощью НСТ-теста, который основан на образовании нерастворимого диформазана из нитросинего тетразолия. Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест. Для постановки спонтанного НСТ-теста к 100 мкл крови добавляли 50 мкл физиологического раствора и 20 мкл нитросинего тетразолия, в индуцированном НСТ-тесте к 100 мкл крови 50 мкл суспензии полистирольного латекса в физиологическом растворе и 20 мкл нитросинего тертразолия. Учитывали количество диформазан-положительных клеток (активность НСТ-теста), для вычисления индекса НСТ-теста оценивали площадь гранул по отношению к площади ядра (единичные пылевидные гранулы - 0; клетки с отложениями, не превышающие в сумме 1/3 площади ядра, - 1; клетки с отложением диформазана более 1/3 площади ядра - 2; превышающие размеры ядра - 3). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием рангового дисперсионного анализа по Фридмену, критерия Вилкоксона. Для оценки зависимости влияния ЭПО на функцию фагоцитов от дозы использован корреляционный анализ с вычислением коэффициента корреляции Спирмена. Отличия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты влияния ЭПО на показатели функциональной активности фагоцитов после 10 мин инкубации при 37 °С представлены в табл. 1 и 2. Как видно, нами не зафиксированы статистически значимые изменения поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма фагоцитов периферической крови. Следует отметить, что на правах тенденции увеличивалась активность, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число, показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста; наибольшие значения средних величин наблюдались при добавлении ЭПО в дозе 30 МЕ/л (200% от физиологического уровня в сыворотке). Установлено, что 30-минутная инкубация ЭПО с цельной кровью приводит к изменению функциональной активности фагоцитов периферической крови (табл. 3 и 4). ЭПО в диапазоне концентраций от 1,88 до 30,00 МЕ/л приводит к активации поглотительной способности фагоцитов: увеличивается активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число. Максимальное увеличение количества активно фагоцитирующих клеток, на 49,9% от среднего значения в контрольной группе, отмечено при добавлении ЭПО в дозе 7,5 МЕ/л (50% от физиологического уровня ЭПО в сыворотке). Эффект ЭПО не зависит от дозы при оценке активности фагоцитоза (коэффициент корреляции Спирмена R=0,21; p>0,05), интенсивности фагоцитоза (коэффициент корреляции Спирмена R=0,17; p>0,05), фагоцитарного числа (коэффициент корреляции Спирмена R=0,13; p>0,05). Влияние ЭПО на кислородзависимый метаболизм в фагоцитах носит неоднозначный характер. Так, эффект ЭПО во всех используемых дозах на показатели спонтанного НСТ-теста отсутствовал (табл. 4). Отмечено, что ЭПО повышает генерацию метаболитов кислорода фагоцитами после индукции частицами латекса только в дозах 3,75 и 15,00 МЕ/л (25 и 100% от физиологического уровня ЭПО в сыворотке); возрастает как количество активных клеток, так и индекс НСТ-теста, отражающий интенсивность генерации кислородных метаболитов отдельной клеткой.
По данным других исследователей, на лейкоцитах обнаружены рецепторы к ЭПО, так, с использованием методов проточной цитометрии и обратной полимеразной цепной реакции были обнаружены экспрессия гена и мРНК рецептора ЭПО в Т- и В-лимфоцитах и моноцитах. Группа исследователей из центра трансплантологии в Бергамо (Италия) полагают, что одной из мишеней для иммуномодулирующего действия ЭПО являются дендритные клетки, экспрессирующие рецепторы к ЭПО, взаимодействие с которыми ЭПО приводит к экспрессии CD86, CD40, TLR-4. При этом данные о влиянии ЭПО на функциональную активность фагоцитов противоречивы. Так, Kristal B. et al. (2008) приводят данные о том, что ЭПО у больных хронической почечной недостаточностью при исходном увеличении вызывает снижение продукции супероксид-анион-радикала нейтрофилами in vivo и ex vivo и увеличивает стабильность (срок жизни) нейтрофилов in vitro. Spaan M. et al. (2013) констатируют активацию поглотительной и снижение киллинговой способности фагоцитов у больных вирусным гепатитом С после культивирования в среде с добавлением ЭПО. Полагаем, что такие противоречивые данные связаны с регулирующим влиянием ЭПО на функциональную активность фагоцитов, эффект ЭПО определяется исходным уровнем функциональной активности клеток. Известно, что внутриклеточная трансдукция сигнала после связывания ЭПО с рецептором обеспечивается многочисленными Jak-2-зависимыми сигнальными путями: трансдукторы сигналов и активаторы транскрипции (STAT-5, STAT-3), фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), протеинкиназа В (РКВ), гликоген-синтаза киназа-3β (GSK-3β), митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) и др . Возможно, такое многообразие сигнальных путей объясняет неоднозначный, модулирующий характер влияния ЭПО на функциональную активность клеточных эффекторов врожденного иммунитета.
Таким образом, результаты проведенного исследования позволили установить, что 10-минутный контакт ЭПО с цельной кровью не оказывает статистически значимого влияния на функцию фагоцитов. В экспериментальных условиях in vitro после 30-минутной инкубации ЭПО с цельной кровью зафиксирована активация поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма фагоцитов периферической крови. Выявлено, что ЭПО в диапазоне доз от 1,88 до 30 МЕ/л увеличивает количество активно фагоцитирующих клеток и поглотительную способность отдельного фагоцита; в дозах 3,75 и 15 МЕ/л ЭПО повышает количество клеток, генерирующих активные метаболиты кислорода, и интенсивность генерации активных метаболитов кислорода отдельным фагоцитом в индуцированном НСТ-тесте. Эффект ЭПО на функциональную активность фагоцитов не зависит от дозы.
Таблица 1. Влияние ЭПО на показатели поглотительной способности фагоцитов периферической крови после 10 мин инкубации (M±m)
|
Условия эксперимента |
Активность фагоцитоза, % |
Фагоцитарное число, у.е. |
|
|
Контроль (+ физ. р-р) (n=10) |
|||
|
ЭПО 1,88 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 3,75 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 7,5 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 15 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 30 МЕ/л (n=10) |
Таблица 2. Влияние ЭПО на показатели кислородзависимого метаболизма фагоцитов периферической крови после 10 мин инкубации (M±m)
|
Условия эксперимента |
Спонтанный НСТ-тест |
Индуцированный НСТ-тест |
||
|
Активность, |
Активность, |
|||
|
Контроль (+ физ. р-р) (n=10) |
||||
|
ЭПО 1,88 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 3,75 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 7,5 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 15 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 30 МЕ/л (n=10) |
||||
Таблица 3. Влияние ЭПО на показатели поглотительной способности фагоцитов периферической крови после 10 мин инкубации (M±m)
|
Условия эксперимента |
Активность фагоцитоза, % |
Интенсивность фагоцитоза, у.е. |
Фагоцитарное число, у.е. |
|
Контроль (+ физ. р-р) (n=10) |
|||
|
ЭПО 1,88 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 3,75 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 7,5 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 15 МЕ/л (n=10) |
|||
|
ЭПО 30 МЕ/л (n=10) |
* - статистически значимые (p<0,05) различия с группой контроля.
Таблица 4. Влияние ЭПО на показатели кислородзависимого метаболизма фагоцитов периферической крови после 10 мин инкубации (M±m)
|
Условия эксперимента |
Спонтанный НСТ-тест |
Индуцированный НСТ-тест |
||
|
Активность, |
Активность, |
|||
|
Контроль (+ физ. р-р) (n=10) |
||||
|
ЭПО 1,88 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 3,75 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 7,5 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 15 МЕ/л (n=10) |
||||
|
ЭПО 30 МЕ/л (n=10) |
||||
* - статистически значимые (p<0,05) различия с группой контроля.
Рецензенты:
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г.Челябинск.
Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г.Челябинск.
Библиографическая ссылка
Осиков М.В., Телешева Л.Ф., Ожиганов К.С., Федосов А.А. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ IN VITRO // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 1.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=12138 (дата обращения: 01.02.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
О возможностях биотехнологии рассказывает к.с.-х.н. Дмитрий Кравченко из ВНИИ картофельного хозяйства.
Рост и развитие под контролем:
возможности биотехнологии картофеля in vitro
Регуляция роста и развития растений - важная задача современной биологии. Изучение регуляторных механизмов на клеточном уровне, контролирующих основные жизненные функции растения, путей управления физиологическими процессами, регуляторными механизмами растительной клетки открывает широкие перспективы для использования потенциальных возможностей.
Зачем нужна работа in vitro ?
Биотехнологические методы, связанные с культивированием в условиях in vitro , стали неотъемлемой частью технологического процесса воспроизводства исходных растений для оригинального семеноводства картофеля. Для оздоровления методами апикальной меристемы и ускоренного размножения культуры in vitro с целью получения возможно большего количества оздоровленного исходного материала для дальнейшего ведения процесса семеноводства необходимо оптимизировать и активизировать процессы роста и развития растений картофеля как в условиях in vitro , так и при получении оздоровленных мини-клубней.
Зачем нужно управлять ростовыми процессами? Назовем основные направления работы с культурой картофеля in vitro :
— оздоровление сортов картофеля от вирусной и иной инфекции (метод апикальной меристемы в различных сочетаниях и модификациях);
— введение в культуру in vitro эксплантатов, полученных от абсолютно здорового картофельного растения;
— микроклональное размножение сортов картофеля в процессе оригинального семеноводства;
— получение микроклубней картофеля;
— длительное поддержание коллекций генотипов картофеля;
— селекционно-генетические и другие исследовательские работы, требующие для своего выполнения материал in vitro .
Ионы Скулачева
Рассмотрим возможности управления ростовыми процессами растений in vitro на этапах оздоровления и микроклонального размножения.
На этапе получения регенерантов из меристематических эксплантов определяющее значение имеют показатели приживаемости объектов, интенсивности процессов их морфогенеза и времени регенерации. Для улучшения данных параметров мы рекомендуем применять новый класс нанопродуктов с геропротекторными свойствами - ионов Скулачева. Синтезированные в НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского (МГУ имени М.В. Ломоносова) препараты SkQ (ионы Скулачева) представляют собой соединения катионов трифенилдецилфосфония и аналогов пластохинона хлоропластов. Они регулируют внутриклеточный баланс активных форм кислорода и различаются по проникающей способности и соотношению анти- и прооксидазной активности.
Добавление препарата SkQ1 в искусственную питательную среду в наноконцентрации 2,5 нМ улучшает приживаемость меристемных эксплантов сортов с более коротким вегетационным периодом на 16–43% и сортов с более длинным вегетационным периодом - на 7–13%.
Одновременно наблюдается значительное повышение морфогенной активности и интенсивности роста эксплантов, в результате чего время регенерации микрорастений из меристемных тканей сокращается на 24 – 30 дней .
После пересадки на новую питательную среду микрорастения из регенерантов, полученных с использованием SkQ1 , характеризовались более быстрым ростом и лучшими биометрическими параметрами. По комплексу показателей лидировали растения, полученные в средах: для начального роста меристем и для дальнейшего роста растений.
Еще быстрее
Таким образом, через 50 дней после вычленения меристем при использовании препарата SkQ1 получены полноценные растения, пригодные для дальнейшего черенкования и проверки на скрытую зараженность вирусами методом ИФА. А еще через 15–20 дней после черенкования отросшие растения можно было высаживать в грунт теплицы или открытый грунт для оценки сортовой типичности и получения мини-клубней. Следовательно, общее время от вычленения меристемы до высадки здоровых растений в грунт можно сократить до 65–80 дней. Увеличивается и количественный выход линий, а значит, вероятность успешного оздоровления.
Автоматизированная система Фитотрон ТФ 600 позволяет получать подобные результаты без применения дополнительных ростостимулирующих веществ, а в сочетании с ними морфогенная активность регенерантов повышается на 12–21%, время получения исходных здоровых растений сокращается на 7–14 дней.
Кроме того, в настоящее время проводятся исследования по влиянию светового излучения различного спектрального состава на снижение вирусной зараженности в растениях in vitro .
Разгоняющие черенкования
После получения оздоровленных исходных растений-регенерантов следующий важный этап воспроизводства - их дальнейшее размножение. При этом задача состоит в быстром увеличении объемов исходного материала при одновременном сохранении высокой потенциальной энергии роста и продуктивности, а также статуса отсутствия патогенов.
Процесс микроклонального размножения следует разбить на 2 этапа: разгоняющие черенкования и последнее черенкование перед высадкой в условия in vivo . Разгоняющие черенкования должны действительно обеспечить максимальный коэффициент размножения в заданные программой семеноводства сроки. В последнем же пассаже предстоит сформировать растения, которые впоследствии будут наилучшим образом адаптированы к условиям выращивания в грунте и дадут высокий урожай стандартных мини-клубней. Поэтому на разных этапах микроразмножения могут применяться разные химические регуляторы и разные физические условия культивирования.
Обеспечить условия
По результатам ранее проведенных исследований мы рекомендовали для разгоняющих черенкований применять препарат эпин (синтетический эпибрассинолид), который ускоряет стеблевой морфогенез растений in vitro и повышает коэффициент размножения. На последнем этапе черенкования рекомендован препарат фумар (диметиловый эфир аминофумаровой кислоты), который стимулировал ризогенез у растений картофеля и обладал пролонгированным положительным эффектом в последействии, повышая урожайность картофеля в полевых питомниках на 9–15%.
Путем тщательного изучения синтезированных в последние годы росторегулирующих веществ нового поколения выявлен препарат, способный при добавлении в искусственную питательную среду увеличивать число листочков микрорастений картофеля, а следовательно и коэффициент размножения, до 9–15 шт. в зависимости от сорта .
Однако подобных результатов возможно достичь при культивировании растений in vitro на стандартной питательной среде Мурасиге-Скуга при оптимизации всех физических параметров выращивания, что может обеспечить установка Фитотрон ТФ 600 .
Можно, но осторожно
Таким образом, действенным инструментом в арсенале манипуляций с объектами в культуре in vitro стало применение биологически активных веществ, оказывающих направленное воздействие на физиологические процессы и механизмы регуляции внутриклеточного обмена веществ. Однако следует учитывать, что многие биологически активные вещества обладают в той или иной степени выраженным мутагенным эффектом. Следует с особой тщательностью и осторожностью подбирать их для тех направлений работы с культурой in vitro , в которых стабильность сортовых признаков картофеля подвергается наибольшему риску.
С другой стороны, внедрение в практику оригинального семеноводства картофеля современных технологических решений, таких как камеры с регулируемыми физическими условиями (Фитотрон ТФ 600 и его аналоги), позволяет частично решить задачу управления ростовыми процессами растений in vitro без применения химической регуляции.
В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.
Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т.д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т.д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М. Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).
Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.
Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологичеки активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.
Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.
Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.
Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.
Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей–использование ее в клеточной селекции.
Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.
Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.
В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.
Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.
Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:
андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор.
гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;
партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.
Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью.
Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.
Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.
Криосохранение растений
Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (температура – 196° С) – новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические и соматические зародыши и т.д. В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физиологии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфогенеза, возглавляемому проф. Р. Г. Бутенко.
При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток: отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды; разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации.
Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения: обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до –40° С (в редких случаях до -70° С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов.
Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготовки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто несколькими способами, предусматривающими культивирование клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2–6%, аминокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно, а также у-аминомасляная кислота.
Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5–10%), глицерин (10–20%), а также непроникающие высокомолекулярные–поливинилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.
Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до –40° С. Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0,5–1 °С в минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).
Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при –40° С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот.
Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет и др.
Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте является последним этапом технологии криосохранения. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Для этого ампулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60° С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда.
Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ – окраска витальным красителем (0,1%-ным феносафранином или 0,25%-ным раствором сини Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.
Экспериментально было показано, что клетки после хранения в жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации растений, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболитов (клетки продуценты) и т.д. Так, Институтом физиологии растений РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана возможность из 20% хранящихся меристем регенерировать целые растения, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам, включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике криосохранения можно узнать из обзорных работ А. С. Попова.
Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений.
