Как проводится и что показывает иммуноферментный анализ. Анализ ИФА: что это такое? зачем он нужен? плюсы и минусы метода Кровь на rw методом ифа

5.1 Сущность и классификация ИФА.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

Рис. 6 Основной принцип ИФА:

для выявления антигенов; 2) для выявления антител

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Образование конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

Достаточной специфичностью в рабочем разведении;

Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

5.3 Гетерогенные методы ИФА.

Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

Рисунок 7.

Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.



5.4 Гомогенный метод ИФА.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА, занимает минуты и даже доли минут).

Рис. 8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа (А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, (несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

5.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Лабораторные анализы помогают врачам не только выявить заболевание, но и определить способность организма противостоять инфекциям. Кроме того, некоторые позволяют установить и стадию патологии. Примером такого исследования является ИФА, который часто используется в диагностике.

Метод ИФА – что это такое?

Иммуноферментный анализ (ИФА) – лабораторное исследование, направленное на выявление в образце крови специфических антител белковой природы к определенным антигенам. Первостепенное значение среди множества антител имеют иммуноглобулины, которые способны существовать в составе иммунокомплексов. Синтезируются они в организме в результате нейрогуморальных реакций иммунной системы после внедрения в организм патогенного агента.

На каждый вид патогенных клеток вырабатываются свои антитела – в качестве ответной реакций. Подробная их диагностика и анализ помогают определить непосредственно тип патологии, которая может присутствовать в организме человека, не проявляя себя. Твердофазный иммуноферментный анализ выявляет скрытые, вялотекущие патологические процессы, определяет их стадию.

Что показывает анализ ИФА?

Разобравшись с тем, что обозначают термином анализ ИФА, что это такое, необходимо отметить основное диагностическое значение исследования. Данный метод используется для определения присутствия в образце крови антигенов возбудителя инфекции и антител, которые являются результатом активации иммунной системы. Среди важных классов антител необходимо выделить IgA, IgM, IgG.

Иммуноферментный анализ крови назначается при необходимости дифференциальной диагностики, постановки окончательного диагноза. Он помогает врачам выявить скрытые патологии. Кроме того, назначаться ИФА может и для оценки уровня иммунной реакции после проведения накануне вакцинации. В большинстве случаев анализ ИФА (что это такое, описано выше) назначается при наличии подозрений на следующие типы патологий:

• гепатит;
• ветряная оспа;
• гельминтозы;
• краснуха;
• полиомиелит;
• герпес;

Кроме того, ИФА на определенные типы иммуноглобулинов может проводиться и при:

• ревматоидном артрите;
• сепсисе;
• хронических гнойных отитах;
• пневмонии;
• менингите;
• синусите;

Как проводится иммуноферментный анализ?

Иммуноферментный анализ, ИФА, проводится путем исследования образца забранной крови. На поверхность предварительно подготовленной специальной планшетки помещают небольшое количество сыворотки крови и очищенного антигена. Соединяя их, наблюдают за происхождением реакции в микроскоп. Антиген и антитело одного вида образует комплекс. Для диагностики его образования проводят дополнительное окрашивание. По интенсивности произошедшего окрашивания делают выводы относительно концентрации иммуноглобулинов в образце сыворотки крови пациента.

Анализ методом ИФА (что это такое, вы уже знаете) чувствителен даже к небольшому количеству иммуноглобулинов, обладает высокой специфичностью. В результате врачи могут с его помощью проводить точную дифференциальную диагностику заболеваний со схожей клинической картиной. Сама процедура анализа длится недолго, поэтому результат исследования можно узнать в тот же день. При необходимости срочной диагностики получить ответ можно спустя 2–3 часа с момента забора крови.

Иммуноферментный анализ крови – подготовка

Метод иммуноферментного анализа перед его проведением требует от пациента некоторой подготовки. В качестве исследуемого материала выступает венозная кровь. Забор ее осуществляется исключительно в утренние часы, натощак. Перед прохождением процедуры пациенту требуется избегать эмоциональных перегрузок, стрессовых ситуаций, исключить физические нагрузки. Для получения объективных результатов исследования перед тем, как сдавать анализ ИФА на хламидии и другие инфекции необходимо:

1. За сутки до анализа из рациона исключают жирные блюда, копчености и алкоголь.
2. Перед исследованием не курить.
3. Последний прием пищи должен происходить накануне анализа с интервалом не менее 8 часов до предполагаемого времени исследования.

Иммуноферментный анализ – забор материала

Анализ методом ИФА предполагает забор венозной крови в качестве биоматериала для исследования. Осуществляется процедура в условиях лаборатории. Из локтевой вены с помощью одноразового шприца забирается образец крови в объеме 5–10 мл. Нередко используют специальные вакуумные пробирки, после подсоединения к которым иглы кровь самостоятельно заполняет емкость. Полученный образец маркируется соответствующим образом и отправляется для дальнейшего обследования. Чаще результат исследования известен на следующий день.

Анализ крови ИФА – расшифровка

Расшифровка анализа ИФА проводится исключительно специалистом. При этом учитываются результаты других исследований, проведенных накануне. Стоит отметить, что ИФА имеет две модификации – качественную и количественную оценку. Положительный результат качественной оценки ИФА свидетельствует о наличии в организме антител к определенному типу возбудителя. В дальнейшем назначается количественная оценка, которая направлена на установление степени болезни, стадии. При отрицательном анализе говорят об отсутствии патогенов в организме малыша.

Анализ ИФА отрицательный

Отрицательный результат анализа не всегда указывает на отсутствие патологии. Так, анализ ИФА на сифилис может быть отрицательным в стадии ремиссии, когда патоген а организме находится в малой концентрации после проведенного курса терапии. Учитывая этот вариант, врачи проводят дополнительное исследование спустя некоторое время. Кроме того, отрицательный результат может наблюдаться и после недавнего инфицирования, когда антитела еще не выработались организмом в диагностической концентрации.

Анализ крови ИФА положительный

При положительном результате анализа проводится определение титра антител, их класса. В большинстве случаев для диагностики инфекционных процессов определяют концентрацию IgG и IgM. Образуются они в разное время.

(ссылка на 3-ю статью в этом файле), позволяющих оценить способность организма противостоять инфекционным болезням и показывающих фазу болезни, важное место занимает иммуноферментный анализ (ИФА). Проведение этого исследования позволяет всесторонне оценить деятельность защитной функции крови и выявить состояние иммунодефицита при инфекционных патологиях, также заболеваниях крови, аутоиммунных процессах, гормональных проблемах.

Каким же образом удается охватить столько целей в одном анализе, и какие имеются показания для его проведения? Попробуем разобраться.

Что такое анализ крови, проводимый методом ИФА

Это лабораторное исследование, которое позволяет определять наличие специфических антител (защитных факторов крови белковой природы) к определенным антигенам (болезнетворным агентам). Среди антител первостепенное значение имеют иммуноглобулины, которые могут существовать в виде иммунокомплексов.

Иммуноглобулины вырабатываются вследствие сложных нейрогуморальных реакций человека, возникающих как ответная реакция на внедрение чужеродных антигенов. На каждый вид болезнетворного агента вырабатываются свои специфические антитела. Действуют они путем «связывания» антигена или патологического микроорганизма, образую комплексное соединение «антиген-антитело» с последующей нейтрализацией, ферментативным лизисом, реакциями фагоцитоза и выводом из организма.

Обратите внимание: именно по наличию определенных комплексов методом ИФА определяется вид возбудителя или имеющегося у больного вредного вещества.

Узнать базовые принципы функционирования иммунитет человека вы сможете, посмотрев данный видео обзор:

Какие бывают иммуноглобулины

Открыто и изучено 5 основных классов иммуноглобулинов – IgА, IgM, IgG, IgD, IgE. роль остальных еще до конца не выяснена и она находятся в стадии научного исследования.

Обратите внимание: наиболее важное в практической медицине значение имеют иммуноглобулины классов – А, М и G. Информативность определения основана на разных временных промежутках их появления, максимума и исчезновения.

Рассмотрим этот вопрос более детально.

Основная задача иммуноглобулина А (IgA) заключается в защитных функциях слизистых оболочек дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы. При остром начале заболевания выявить их невозможно. Появляются эти защитные комплексы лишь со 2 недели начала заболевания, иногда позже. Основная масса иммуноглобулина А сосредоточена в слизистых тканях. Ориентировочно около 80%. Остальные антитела циркулируют в крови. Основная функция – обезвреживание и уничтожение микроорганизмов. После стихания острых проявлений заболевания количество этих иммуноглобулинов начинает уменьшаться и полностью уходит на сроке до 8 недель после начала болезни. Если IgA обнаруживаются в более поздние сроки, то это свидетельствует о хронизации процесса.

Главными и первыми маркерами острой фазы развивающейся патологии являются иммуноглобулины класса М (IgM) . Обнаруживаются они к 5 суткам начала недомогания. Определить их наличие в крови можно около 6 недель. Затем они начинают быстро исчезать.

Остаточный иммунный ответ характеризует наличие в крови иммуноглобулинов класса G (IgG) . Появление этих факторов в крови обнаруживается примерно через месяц после начала болезни. В дальнейшем они могут определяться в течение многих месяцев, лет и даже всю жизнь, выполняя защитную функцию от возврата (рецидива) болезни, а в некоторых случаях делая невозможным вторичное развитие патологии. Если же количество иммуноглобулина G начало вновь расти, то можно подозревать повторное заражение. Подобный вывод можно сделать путем проведения двух-трех проб, сделанных с промежутком в 2 недели.

Иммуноглобулин D (IgD) располагается на B-лимфоцитах, находится в небольшой концентрации у здоровых людей. После 10 года жизни достигает максимальных значений. Количество иммуноглобулина D увеличивается при беременности, у больных системными заболеваниями соединительной ткани, заболеваниями, вызванные иммунодефицитным состоянием.

Показания к назначению иммуноферментного анализа крови

Определение антител к наличию в организме болезнетворных микробов, вызывающих:

• трихомоноз;
• уреаплазмоз и .

Имеется рост количества иммуноглобулинов и при .

Диагностика проводится для обнаружения:

• герпетических заболеваний;
• группы вирусных гепатитов;
• вируса Эпштейна-Барра;
• цитомегоаловируса.

При помощи ИФА можно определять наличие антител к 600 видов аллергенов, обнаруживать состояние иммунодефицита, проводить комплексное обследование перед трансплантологическими операциями, проводить комплексный анализ на предмет эффективности лечения.

ИФА является дополнительным методом обнаружения онкологических клеток.

Как проводится ИФА крови

Для иммуноферментного анализа в большинстве случаев используется кровь пациентов, иногда производят забор ткани стекловидного тела, жидкости спинномозгового канала, околоплодных вод.

Кровь набирают через инъекционную иглу в шприц из локтевой вены. Исследование проводят натощак. Следует помнить, что прием некоторых медицинских препаратов может влиять на результат анализа. Перед сдачей крови необходимо воздержаться от курения, приема алкоголя. Исказить результаты может прием наркотических веществ.

В случае отрицательных значений иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA можно говорить об отсутствии заболевания или его начальной фазе, также результат с минусами возможен при полном выздоровлении по прошествии значительного количества времени.

Если IgA и IgM не обнаружены, а IgG проявляется положительно, то по всей вероятности речь идет о сформированном иммунитете после инфекционного заболевания, или после прививки.

В случае высокого титра IgM при отрицательных значениях IgG, IgA можно делать вывод о наличии остро протекающего инфекционного заболевания.

Одновременные положительные значения результатов иммуноглобулинов – IgA, IgM, IgG характерны для острой фазы рецидива имеющегося хронического заболевания.

Для хронической инфекции, находящейся в фазе стихания процесса (ремиссии) ИФА показывает отрицательные значения иммуноглобулина M (IgM), при этом результат иммуноглобулинов G (IgG) и A (IgA) будет положительным.

Преимущества метода иммуноферментного анализа крови

Главными достоинствами метода ИФА являются:

• невысокая себестоимость анализа;
• диагностическая специфичность, точность;
• динамический контроль (повтор анализа для определения эффективности лечения и стадий заболевания);
• возможность проведения массовых обследований в очагах инфекции;
• скорость получения результата;
• относительная простота анализа;
• возможность использования информационных технологий в обработке;
• безопасность и безболезненность для пациента.

Есть ли недостатки у ИФА крови?

Главным отрицательным моментом исследования является возможность получения ложноотрицательных и ложноположительных данных. Причиной недоразумений могут стать технические недочеты, прием медикаментов, который может исказить картину.

ИФА применяется для обнаружения:

• (аскарид, остриц);
• острой и хронической формы описторхоза;
• трихинеллеза;
• наличия лямблий (как дополнительный анализ);
• форм лейшманиоза;
• амебиаза;
• содержания токсоплазм;

В заключение необходимо отметить, что современная иммунология постоянно находится в стадии развития, поиска новых методов диагностики и лечения заболеваний.

Степаненко Владимир, хирург

Перечень доступных методик диагностики в последние десятилетия быстро расширяется, диагносты пытаются в новых методах объединить преимущества всех прежних анализов, избавившись от всех их прежних недостатков.

В последнее время все чаще в перечне диагностических процедур фигурирует иммуноферментный анализ - современный и достаточно новый тест, о котором мало известно обычному человеку, не связанному с медициной. Тем не менее эта методика стремительно пополняет ряды своих приверженцев среди квалифицированного медперсонала. Что она представляет собой и в каких случаях ее следует использовать, можно попытаться разобраться, ознакомившись с ее особенностями и главными характеристиками.

Иммуноферментное исследование - инструментально-лабораторная методика, построенная на молекулярной реакции «антиген-антитело», позволяющая обнаруживать специфичные белки в биологических материалах (образцах для исследования). Такими белками могут быть энзимы, разнообразные микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибки), простейшие и т. д.

После открытия метода ему было дано название ELISA-тест, что не имеет отношения к имени первооткрывателей, а является аббревиатурой полного названия в английском варианте - enzyme-linked immunosorbent assay. Медики всего мира используют это название, некоторые врачи в русскоязычных странах тоже так называют этот тип исследования.

Основной принцип метода заключается в молекулярной реакции «антиген-антитело».

Антигеном является любая чужая молекула, попавшая в человеческий организм в составе микроба-возбудителя болезни. Антигены представляют собой, как правило, белковые молекулы. Кроме микроорганизмов таким «чужаком» могут быть клетки чужой крови, не совпадающие по группе или резус-фактору.

В ответ на попадание такого антигена в организме запускается иммунная реакция, которая направлена на защиту от любых чужих молекул. Это происходит за счет синтеза специальных агентов иммунной системы - антител (иммуноглобулинов). Каждое антитело подходит только к определенному антигену, и нейтрализует патогенного «чужака», связываясь с ним в единый комплекс. Именно процесс такого связывания и называют реакцией «антиген-антитело».

Виды антител

Все антитела (иммуноглобулины) делятся на 5 видов в зависимости от того, на каком этапе иммунного ответа они появляются:

Для ИФА-диагностики чаще всего важны уровни иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA. По их титрам можно узнать, переболел ли человек болезнью раньше или заразился в недавнем времени, выработался ли у него иммунитет или его организм беззащитен перед патологией.

Достоинства и недостатки иммуноферментного анализа

На данный момент ИФА - один из самых точных и чувствительных методов. Он взят на вооружение специалистами в разных областях медицины и продолжает расширять сферы применения.

Преимущества метода

• Высокая точность полученных данных.
• Чувствительность (позволяет обнаружить необходимое вещество даже при минимальном присутствии возбудителя в образце).
• Возможность диагностики в первые дни болезни или в инкубационном периоде.
• Скорость получения данных в сравнении с другими методиками подобной точности.
• Высокая автоматизация процесса и минимальное участие человека, что снижает погрешность исполнителя.
• Получение данных о стадии патологического процесса и эффективности выбранной терапии.
• Безболезненность и малая инвазивность при отборе материала.

Недостатки метода

• В большинстве случаев позволяет определять ответ организма на патогенный агент, а не самого возбудителя.
• Перед исследованием должно быть точно известно предполагаемое заболевание, так как тест высокоспецифичен.
• Вероятность ложных показателей, вызванных техническими моментами, приемом лекарственных средств, одновременным присутствием нескольких хронических заболеваний или нарушениями обменных процессов в организме больного.
• Интерпретацию результатов должен делать только высококвалифицированный специалист, так как для трактовки полученных данных необходимо владеть специальной подготовкой и большим запасом медицинских знаний в определенной области.
• ИФА - достаточно редкий анализ, поэтому выполняют его далеко не во всех диагностических лабораториях.
• Метод довольно дорогой, так как помимо реактивов в лаборатории должно быть дорогостоящее многочисленное оборудование и образцы антигенов, изготавливаемых в специальных институтах.

В каких случаях используют иммуноферментный анализ

Полный перечень показаний к назначению иммуноферментного исследования очень широк, он включает в себя практически все отрасли медицины.

Чаще всего ИФА применяют для таких целей:

• выявление инфекционных заболеваний;
• диагностика венерических болезней;
• определение иммунного статуса или отдельных аутоиммунных заболеваний;
• идентификация онкомаркеров;
• определение гормонов.

В случае инфекционных и вирусных заболеваний методика позволяет выявить следующие патологии:

Кроме того, ИФА позволяет быстро и эффективно определить инфарктное состояние, оценить репродуктивный потенциал организма, выявить аллергию, ее источник и пр.

Иммуноферментная методика используется для проведения клинических исследований в ходе разработки новых лекарственных препаратов и в оценке их влияния на организм человека.

Типы образцов и методы их отбора для исследования

Чаще всего исследуемым материалом для иммуноферментного анализа служит кровь, которую берут из локтевой вены пациента. Отбор пробы проводится натощак, преимущественно в утреннее время. После отбора из крови отделяют и убирают те форменные клетки, которые мешают проведению исследования, оставляя только сыворотку.

При диагностировании мочеполовых инфекций часто материалом становятся мазки из слизистых тканей половых органов, слизь из уретры или шейки матки, образцы из прямой кишки, соскобы с эрозий или язв в области паха и с других участков тела. Мазки могут брать и с ротовой полости, а также с носоглотки.

Иногда иммуноферментное обследование используется в акушерской и гинекологической практике во время беременности для определения состояния околоплодных вод. В таком случае образцом становится амниотическая жидкость. Для этого отбирают небольшое количество жидкости, проколов плодный пузырь длинной иглой. Все манипуляции проводят стерильным инструментом, чтобы минимизировать возможные риски.

Нередко материалом становится спинномозговая или серозная жидкость. Это происходит при местной анестезии, которая вводится инъекционно.

Уточнить, какой тип материалов необходим для иммуноферментного анализа, должен специалист, направляющий на исследование. Часто берутся образцы сразу нескольких типов или из разных мест. Про подготовку к сдаче биоматериала пациенту тоже должен рассказать врач, выдающий направление на этот тип обследования.

Подготовка к иммуноферментному анализу

Для увеличения точности данных, полученных после иммуноферментного обследования, подготовка к отбору материала должна быть такой:

• за 10 суток до исследования исключить антибиотики, противовирусные и антимикотические препараты;
• за сутки необходимо исключить спиртное, курение и прием наркотических веществ;
• в этот же период необходимо избегать физического перенапряжения;
• предупредить специалиста, выписывающего назначение, о всех лекарствах, которые пациент принимает;
• оповестить врача в случае беременности или подозрении на беременность.

Лучше всего, если материалы для тестирования будут отобраны утром натощак.

Если диагностика ставит цель определить состояние гормонального фона, то важно обеспечить себе спокойное состояние накануне и избегать нервного напряжения. Для женщин сдача крови на гормоны четко определяется периодом месячного цикла, о чем будет сказано врачом в момент назначения.

За 2-3 дня до отбора материала нужно исключить из меню жареное и жирное, а перед анализом на гепатит не есть цитрусовые и любые другие фрукты и овощи оранжевого и желтого цвета.

Расшифровка результатов иммуноферментного анализа

Результат качественного исследования, как правило, обозначается знаками «+» (обнаружено) или «-» (не обнаружено).

По наличию или отсутствию определенных групп иммуноглобулинов можно делать такие выводы:

• JgM (-), JgG (-), JgA (-) - иммунитет к заболеванию полностью отсутствует (с таким типом антигена организм ранее не сталкивался);
• JgM (-), JgG (+), JgA (-) - ранее было столкновение с данным антигеном или с вакциной;
• JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+) - острый патологический процесс (скорее всего первичный);
• JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) - процесс хронического течения;
• JgM (+), JgG (+), JgA (+) - рецидив;
• JgM (-) - стадия выздоровления.

Количественные значения несут большую информационную нагрузку, но трактовать их способен только лечащий врач, исходя из предыдущих показаний, возраста пациента, норм для каждого конкретного заболевания. Именно по этой причине оценивать результаты самостоятельно нельзя.

Сколько необходимо ждать результаты

Данная методика имеет много разновидностей, в зависимости от которых и определяется срок получения данных на руки. Средняя продолжительность ИФА-диагностики составляет 4-6 часов, что позволяет выдать результаты уже на следующий день.

Самые продолжительные методики занимают до 10 дней, например, в случае выявления ВИЧ-инфекции.

При острой необходимости возможно применение экспресс-методик, при которых ответ получают уже через 1-2 часа.

Где можно пройти ИФА тестирование

Поскольку оборудование для проведения такого типа диагностики довольно дорогое, то приобрести его могут не все лаборатории. Кроме того, тесты, содержащие специфические антигены, имеют ограниченный срок годности (обычно около 1 года), поэтому нуждаются в постоянном обновлении.

По этим причинам в государственных медицинских учреждениях ИФА-лаборатории есть далеко не всегда. Чаще всего необходимо обращаться в большие частные медицинские или крупные диагностические центры.

Для проведения ИФА-исследования лаборатория должна иметь специальную лицензию, а персонал и лаборанты должны пройти специальное обучение.

Чаще всего конкретный диагностический центр или лабораторию рекомендует врач, направляющий пациента на обследование.

Стоимость иммуноферментного исследования

Цена на данное исследование зависит от региона страны и от уровня клиники, предоставляющей услугу. В Москве минимальная цена за определение одного антигена стартует от 700 руб. Если необходимо выявить сразу несколько иммуноглобулинов, то цена будет суммироваться.

В случае срочного анализа стоимость увеличивается на 150-200 руб. за каждый антиген.

Несмотря на достаточно высокую стоимость, иммуноферментный анализ позволяет сделать обследование пациента максимально информативным и быстрым, что сокращает время до начала лечения и позволяет быстрее стабилизировать состояние человека.

На данном видео представлен фильм «Основы иммуноферментного анализа».

Время от времени врачи назначают анализы ИФА что это такое знают далеко не все. ИФА расшифровку имеет следующую – иммуноферментный анализ крови. Такое исследование крови помогает понять, как организм борется с болезнями инфекционного спектра и продемонстрировать фазу заболевания. Иммуноферментное исследование помогает в оценке защитной деятельности крови, выявлении иммунодефицита при патологиях, связанных с инфекциями, гормональных проблемах и прочем.

Анализ крови ИФА работает с материалом, который забирается из вены. Кроме этого, доступно для исследования содержимое стекловидного тела, жидкость из спинного мозга, мазки из уретры или цервикального канала. Для иммуноферментного анализа ИФА у беременных женщин могут забирать жидкость, которой окружен плод.

При этом непосредственно кровь на ИФА может проверяться с использованием разных техник. Есть прямой, непрямой способ, конкуренция и блокировка. При заражении организма каким-то болезнетворным агентом, который именуется антигеном, иммунитет начинает вырабатывать специфические антитела, например, на гепатит. Эти антитела направлены на то, чтобы «разобраться» с чужеродными агентами. Что такое антитела? Это особые белки, которые могут вступать в связь с антигенами и образовывать комплексы иммунологической направленности, которые именуются антиген-антитело. Именно за обнаружение этих комплексов и отвечает ИФА диагностика. Чтобы выявить антиген, к полученному кровяному образцу добавляются антитела или выполняется обратная процедура.

ИФА положительный результат строится на реакции иммунитета и ферментов. Под действием первой агенты инфекций и клеточные элементы связываются, вторая помогает визуализировать результат первой. Иммунная реакция предполагает антительную и антигенную связку. В результате этого процесса и формируется комплекс иммунной направленности. Все клетки на своей поверхности имеют антиген. Иммунной клеткой осуществляется захват подозрительной, а антиген, который закреплен на поверхности, проходит процедуру сравнения с информацией, которая «загружена» в память. Если присутствует совпадения описания, то клетка возвращается восвояси, если же нет, то происходит связь, за создание которой отвечает антитело, которое крепится к поверхности.

Ферментативная реакция тем временем позволяет веществам преобразиться в новые. На материал выполняется воздействие ферментом. При этом ферментальное различие обеспечивается разными субстратами. Продукт, который стал следствием этой реакции, отправляется на определение количества возбудителя, определение которого основывается на плотности растворной окраски.

Особенности метода

Иммуноферментный анализ крови назначается, когда нужно диагностировать аллергию, болезни, имеющие вирусное происхождение. Есть и анализ ИФА на сифилис и целый ряд других инфекций, передача которых происходит при незащищенном половом контакте. Такая диагностика становится все более популярной в сравнении с ПЦР. Дело в том, что ПЦР предполагает работу с мазками. В отличие от ПЦР результаты ИФА могут быть получены при кровяных проверках.

Кроме этого, анализ крови методом ИФА может назначаться, когда нужно установить присутствие иммунодефицита, диагностировать онкологию, дать оценку тому, насколько эффективно лечение, определить гормональный уровень и пройти предоперационное обследование в комплексе.

Если сравнивать исследования методом ИФА, например, с ПЦР, то можно обнаружить целый ряд преимуществ. Основным является возможность полной диагностики даже на самых ранних стадиях развития. Кроме этого, результаты ИФА помогают в определении конкретной стадии заболевания, того, на каком уровне находится его развитие.

ИФА анализ в сравнении с ПЦР имеет более высокую эффективность, кроме того, сдавать его можно во время беременности, чтобы обнаружить ЗППП. Тот, кто сдал этот анализ, может узнать концентрацию ТТГ в сыворотке крови. Это очень важно, чтобы проверить, какова реакция щитовидной железы, присутствуют ли сбои в ее работе.

Дополнительными плюсами, впрочем, их имеет и полимеразная цепная реакция, является быстрота исследования, а значит, быстрое получение результатов. По достоинству оценивают врачи и точность результатов. Если речь идет о ЗППП, то уровень доходит до 98 процентов, как и в случае с концентрацией ТТГ.

Конечно, без недостатков не обходится. Однако в этом случае речь идет о косвенных особенностях теста. В частности, речь идет о том, что нельзя исключить возможные ошибки при определении норм. Иногда анализ, который сдавала абсолютно здоровая девушка, может продемонстрировать ложноположительный результат, или отрицательный в обратном случае. Однако классификация методов психологического исследования в большинстве случаев связывает такие недочеты с неправильной подготовкой или нарушением техники, с которой выполнялся забор материала.

Особенности выполнения

При ИФА анализе в большинстве случаев сдается кровь. Перед сдачей крови важно выдержать не менее чем восьмичасовое голодание, исключить прием ряда медицинских препаратов, которые оказывают влияние на результат анализа. Речь идет об антигистаминных медикаментах и гормональных препаратах, влияющих на работу щитовидки. Кроме этого, исключен должен быть алкоголь не менее чем за сутки. Обеспечьте отсутствие курения не менее чем за час до сдачи крови. Искажение результата возможно и при приеме наркотических веществ.

Прежде чем перейти к расшифровке, стоит упомянуть, какие способы измерения используются для такого теста. В результате анализа будут указываться антитела или иммуноглобулины Ig. Под ними понимаются те самые специфические белки, о которых ранее шла речь. За выработку их отвечают В-лимфоциты, как только в организм попадают вирусы, бактерии или грибки. Выделяется пять видов иммуноглобулинов, обозначающихся латиницей.

Отличия их связаны с разной молекулярной формой и массой. У них разный период полураспада, по-разному принимается участие или не принимается в инфекционных процессах. Варьируются и сроки, в рамках которых их можно обнаружить с момента, как произошло инфицирование.

Если классифицировать иммуноглобулины, используя в качестве основы молекулярный вес, то самые большие показатели у IgM. Особенностью такого типа иммуноглобулинов является отсутствие возможности прохождения через плацентарный барьер. Если IgM обнаруживается в анализе у новорожденного ребенка, речь идет о присутствии инфекции у плода.

В подавляющем большинстве в крови у человека содержатся иммуноглобулины IgG, меньше всего IgE. Говоря о работе в рамках инфекционных процессов, особенное значение стоит уделять вариантам A, M, G. IgE выступает в качестве маркера аллергической реакции. IgD обнаруживается только в тканях лимфоузлов и миндалин. Это важно с точки зрения создания иммунитета местного уровня.

Кроме этого, в анализе определяются антигены. Под ними понимаются вещества высокомолекулярного типа, которые известны своим органическим происхождением. В частности, речь идет о возбудителях заболеваний инфекционного и другого спектра. Кроме этого, имеются в виду и вещества, сигнализирующие о различных изменениях клеток, которые неизбежны при целом ряде болезней. Также указывается и иммунный комплекс, который демонстрирует комплекс антиген-антитело, которым принимается участие в иммунном процессе.

Обычно сроки изготовления зависят от конкретной лаборатории, в которую вы обратились. Ряд лабораторий в состоянии предоставить результаты в течение дня-двух, другим требуется неделя. Задержки могут быть связаны с необходимостью накопить определенное количество сыворотки.

Влияние на результаты и расшифровка

Несмотря на то, что ИФА считается одним из наиболее точных методов проверки, погрешности все-таки встречаются. Повлиять на правильность результатов может процедура взятия материала, неправильная его транспортировка и хранения материала. Прием медикаментов, как уже указывалось выше, присутствие скрытых заболеваний. Нарушение обмена веществ или иммунодефицит тоже не позволят получить верные показатели. В период жизни до года у новорожденных тоже могут быть не совсем верные показатели. Связано это с тем, что в организме присутствуют материнские антитела.

Говоря о расшифровке, в бланках анализа используется положительный или отрицательный знак, которым обозначаются результаты вычисления по каждому из иммуноглобулинных классов. В качестве вероятных вариантов будут выступать следующие.

Отсутствие обнаруженных IgG, IgA и IgM говорит о полном выздоровлении. Отрицательный результат по таким компонентам как IgM, IgA, IgG – это отсутствие иммунитета к инфекции.

Сочетание положительного и отрицательного результата по IgG, IgA в комплексе с положительным IgM говорит о присутствии в организме инфекции в острой форме. Положительный результат IgG комбинируемый отрицательными показателями по IgA и IgM соответствует поствакцинальному периоду или приобретению иммунитета в результате перенесенной инфекции.

Сочетание положительного или отрицательного результата IgG, IgA и отрицательного результата, IgM говорит о присутствии инфекции в хроническом ее течение. Положительный результат по трем компонентам: IgG, IgM, IgA обозначает обострение инфекции, которая находилась в хронической форме протекания. Кроме непосредственно уточнения антителовых классов, в рамках расшифровки анализа ИФА врач получает информацию об их количественных показателях. Важно подчеркнуть, что за расшифровку должен отвечать именно лечащий врач. Дело в том, что сочетание некоторых компонентов может натолкнуть его на мысль о полученном ложном результате, что приведет к повторной сдаче. Самостоятельная расшифровка в таком случае бесполезна.